海胆胚胎静态毒性试验及结果分析
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海胆与其他生态毒理学试验动物相比，具有种类多、分布广、容易获得、便于培养、基础生物学数据完备等优点。海胆胚胎具有多种较为显著的毒理学指标（如胚胎的受精率、胚胎发育的延滞率和胚胎的畸形率等）［1］，海胆的配子和胚胎已被广泛用于农药、有机物化合物、重金属、石油类及污染海域生物毒性评价的毒理学指标［2－3］。1995年美国环境保护局将海胆胚胎毒性试验方法列为标准的生态毒理学试验方法［4］。大量研究表明，海胆早期的胚胎发育对金属离子特别敏感［3，5－6］。因此，海胆胚胎毒性试验结果常被用于重金属污染海域的生物水质评价［7］。我国北方近岸局部海域存在较为严重的重金属污染。Wang等［8］报道，渤海海水中Pb的平均浓度超过国家一类海水水质标准。彭士涛等［9］报道，渤海湾天津近岸沉积物中存在Zn、Hg、Cu、Pb和Cd等5种重金属污染。目前，我国的海水水质评价仅局限于对污染物的浓度评价，而有关污染物的生物毒性评价，特别是养殖海域污染物的生物毒性评价尚属空白。因此，笔者以我国北方沿海常见种—光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus）的胚胎为试验材料，研究Zn、Hg、Cu、Pb、Cd对其受精率和胚胎发育的毒性作用，通过观察5种重金属对光棘球海胆超微结构的损伤，初步探讨了其可能的毒性作用机制，为我国近岸海域水质环境的生物学评价提供基础数据。
1 材料与方法
1．1 材料和试剂
试验用光棘球海胆取自辽宁省海洋水产科学研究院培育的F1代家系。分别取性成熟雌性和雄性个体，用0．5mol／L的KCl溶液刺激海胆生产配子，分别收集卵子和，将精 液用过滤海水按1∶100配制成稀释液备用。氯化锌（ZnCl2），氯化镉（CdCl2），氯化汞（HgCl2），硫酸铜（CuSO4），乙酸铅［Pb（CH3COO）2］均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，分别用蒸馏水配制成0．1mol／L，0．1mol／L，0．1mol／L，0．01mol／L，0．1mol／L的储液，备用。
1．2 试验方法
试验浓度设置：5种重金属的浓度设置参考Radenac等［10］的研究结果，均设置了低、中、高3个暴露浓度，其中Cd、Pb、Cu、Zn的暴露浓度均为0．1、0．5、1．0μmol／L；Hg的 暴 露 浓 度 为0．01、0．05、0．1μmol／L，同时设置空白对照组。暴露试验在2L的玻璃烧杯进行，各试验浓度设置2个烧杯，每个烧杯中加入2L过滤海水，再分别加入重金属储液至试验浓度，试验开始后每个烧杯中先放入10 000枚光棘球海胆的卵子，再加入100μL的光棘球海胆的稀释液，充分搅匀。15min后取样，每个烧杯各取1000枚卵用5％的甲醛溶液固定，每次取200枚卵子在解剖镜下观察，统计受精率。48h后对照组光棘球海胆胚胎发育至长腕幼虫时取样。每个烧杯各取1000个光棘球海胆胚胎，用5％的甲醛溶液固定，用于观察统计。试验重复1次。
1．3 电镜切片与观察
光棘球海胆经中浓度重金属溶液暴露2min，立即用3％的戊二醛（pH 7．4的0．1mol／L磷酸缓冲液配制）固定2～4h（4 ℃）后，1％琼脂预包埋，切成1 mm3的小块，用戊二醛固定10h。经pH 7．4的0．1mol／L磷酸缓冲液浸洗，再用1％的锇酸固 定2h，乙 醇 梯 度 脱 水 后，用 丙 酮 脱 水，Epon812包埋，LKB－NOVA超薄切片机切片。日立H－7000透射电镜观察生殖腺结构变化并拍照。
1．4 数据统计与分析
试验结果用平均值±标准差表示，对照组和每个重金属暴露组之间进行t检验，P＜0．05为差异显著，P＜0．01为差异极显著。
2 结果与分析
2．1 5种重金属对光棘球海胆卵子受精率的影响
在水温（21±0．5）℃、盐度32条件下，对照组光棘球海胆卵子的受精率高达（96．31±0．58）％（图1）。由图1可见，与对照组相比，0．01、0．05、0．1μmol／L的Hg和0．1、0．5、1．0μmol／L的Cu、Zn、Pb、Cd暴露后，光棘球海胆卵子的受精率极显著地降低；并随着重金属暴露浓度的升高受精率逐渐降低，具有剂量—效应关系。其中Cu暴露后受精率下降幅度最大，表明5种重金属离子中，Cu对光棘球海胆精卵结合的毒性作用最大。比较5种重金属对光棘球海胆卵子受精率的影响结果，发现5种重金属对受精毒性作用为：Hg＞Cu＞Zn
＞Pb＞Cd。
2．2 5种重金属对光棘球海胆胆胚胎发育的毒性作用
在水温 （21±0．5）℃、盐度32条件下，对照组光棘球海胆胚胎发育48h进入长腕幼虫时期，其中正常的长腕幼虫的比例为（95．16±0．68）％，胚胎发育的延滞率和畸形率分别为（2．29±0．16）％、（2．55±0．56）％。与对照组相比，0．01、0．05、0．1μmol／L Hg暴露后，光棘球海胆正常长腕幼虫的百分比极显著降低，随着暴露浓度升高呈下降趋势，具有剂量—效应关系，胚胎延滞率和胚胎畸形率均极显著上升，同样具有剂量—效应关系。经比较发现，Cu、Pb、Zn、Cd对光棘球海胆胚胎的毒性作用与Hg的毒性作用相似。其中，1．0μmol／L Cu处理组未观察到长腕幼虫个体（表1）。通过比较5种重金属离子对光棘球海胆胚胎的毒性作用结果发现，5种重金属对光棘球海胆胚胎的毒性作用为：Hg＞ Cu＞ Pb＞ Zn＞ Cd。
2．3 5种重金属对光棘球海胆超微结构的损伤
5种重金属暴露后，光棘球海胆超微结构受到了不同程度的损伤（图2）。对照组光棘球海胆呈规则的子弹头形，其头部为顶体结构，基部线粒体对称分布结构完整，整个的外膜清晰（图2a）。0．5μmol／L Cd暴露后，光棘球海胆外膜空泡化（黑色箭头，图2b），基部线粒体形状不规则（图2b）。0．5μmol／L Pb暴露后，光棘球海胆基部线粒体形状不规则，内嵴部分溶解（白色箭头，图2c），质 膜 部 分 断 裂 （黑 色 箭 头，图2c）。0．5μmol／L Zn暴露后，光棘球海胆外膜空泡化（黑色箭头，图2d），线粒体内嵴部分溶解（白色箭头，图2d）。0．5μmol／L Cu暴露后，光棘球海胆基部线粒体内部空泡化（白色箭头，图2e）。0．5μmol／L Hg暴露后，光棘球海胆头部质膜溶解（黑色箭头，图2f），线粒体内嵴断裂（白色箭头，图2f）。
3 讨论
大量研究表明，海胆的配子和胚胎对多种污染物均较为敏感［1－3，7］。本试验也发现，在0．01～1．0μmol／L的试验浓度下，光棘球海胆卵子的受精率即受到5种重金属的极显著抑制，且随着暴露浓度的增加，受精率逐渐降低，具有剂量—效应关系，表明5种重金属离子对的精卵结合过程具有很强的毒性作用。这与Sabine等［11］的试验结果一致，Sa－bine等［11］研究发现，浓度大于6．3μmol／L Cu可以显著降低海胆 （Psammechinus miliaris）卵子的受精率，并具有剂量—效应关系。重金属离子对海胆受精率的抑制作用，可能与重金属离子改变卵膜Ca信号强度，降低海胆配子质量和运动能力有关。Cu通过增加卵膜Ca信号强度，导致卵子的受精率的降低；重金属通过影响的Ca通道和平衡，从而影响无脊椎动物的顶体反应和运动能力，而的运动能力直接与成功受精密切相关［12］。本试验还发现，经0．5μmol／L Zn、Cd、Cu、Pb和0．05μmol／L Hg单独暴露2min，即可导致光棘球海胆超微结构的损伤。其中，外膜的断裂、溶解，空泡化，改变了质膜的通透性，会造成运动能量转化的降低，从而影响的内稳态平衡，降低了的质量；基本线粒体内嵴的溶解、质膜的断裂和空泡化，严重影响了的运动能力。因此，5种重金属对光棘球海胆卵子受精率的抑制作用，可能与5种重金属降低海胆配子质量和活力有关。
此外，重金属可以导致海胆胚胎发育的畸形、延迟、甚至死亡。Gayle等［13］发现，As、Ni、Cr可以造成海胆胚胎细胞的DNA－蛋白质交联，从而导致胚胎发育畸形。Kobayashi等［5－6］发现，含有多种重金属离子的海水对海胆胚胎具有较强的致畸作用。Zn作为海胆胚胎发育的抑制剂，可使海胆胚胎发育停滞或延迟，并具有较强的致畸作用。本试验发现，Hg、Cu、Pb对海胆胚胎的毒性作用要大于Zn的毒性作用。其中，Pb对海胆受精率有抑制作用，对海胆的胚胎发育也有较强的毒性作用。有关5种重金属对光棘球海胆受精和胚胎的毒性作用差异及对胚胎发育联合毒性作用，尚有待于进一步研究。