浅谈苦参素防治阿霉素肾病鼠肾小球硬化
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苦参素 多柔比星 副作用 肾病综合症肾病，肾脏的各种病证。人体脏腑之间，内环境与外环境之间均保持着动态平衡。内外界多种致病因素如果破坏了人体的平衡，导致脏腑气血功能失调，病及于肾，则引起肾脏疾病的产生。肾脏有强大的代偿功能，在肾脏病变早期或者不太严重的时候，患者大都没什么感觉，即使部分患者有腰酸、浮肿、食欲差等不适，也大都将其归因于劳累、亚健康等，很少会联想到可能是肾脏出了问题。等出现了高血压、贫血等肾功能不全症状去就医时，肾功能已基本丧失，发展到了中期或尿毒症阶段。因此，定期体检就显得尤为重要。本文研究采用小剂量大鼠尾静脉注射阿霉素的方法构建肾病慢性进展模型，予OM进行干预治疗，探讨OM对肾病慢性进展模型的作用并进一步探讨其机制。
1材料和方法1.1材料Wistar雄性大鼠60只（由兰州大学基础医学院动物房提供），2月龄，体质量180～200g。苦参素，宁夏紫荆花药业有限公司，批号40040909；盐酸阿霉素10mg/瓶，浙江海正药业股份有限公司，批号040801；兔抗大鼠TGFβ1，Smad1，2，3，5，Smad7mAb，SABC试剂盒，DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物制品公司。1.2方法1.2.1模型的制备与分组60只雄性Wistar大鼠适应性喂养2wk后随机分为正常对照组（A组，15只），OM50mg/（kg？d）治疗组（B组，15只），OM100mg/（kg？d）治疗组（C组，15只），模型组（D组，15只）。除正常对照组外其余各组大鼠分别于实验第1日、第21日尾静脉注射阿霉素2mg/（kg？d），正常对照组予等量生理盐水尾静脉注射。于第二次注射药物后（即实验第22日），各干预组（B组，C组）给与相应剂量的OM进行灌胃，正常对照组予等量的生理盐水灌胃直至实验结束，实验共进行27wk。每隔8wk处死一批大鼠进行指标检测。1.2.2指标检测①24h尿蛋白测定：用代谢笼收集大鼠实验之第0，3，7，11，15，19，24和27wk时24h尿液，用三氯乙酸法测定尿蛋白含量。②血生化检测：每批处死动物之前股静脉取血用全自动生化分析仪（BeckmanCoulterLX20）测定血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）。③肾脏病理改变：大鼠处死后立即用质量分数为40g/L甲醛固定肾组织，常规石蜡包埋、切片，HE方法染色后观察肾脏的病理改变，参照Raij等的方法评估肾小球硬化程度，每张切片至少观察40个肾小球，根据肾小球硬化灶所占肾小球比例分为5个等级：0级：基本正常；（+）：肾小球硬化面积1%～25%；（）：硬化面积26%～50%；（）：硬化面积51%～75%；（）：硬化面积达到76%～100%。用公式计算出肾小球硬化指数（glomerulosclerosis index，GSI）表示肾小球硬化程度，每张切片肾小球平均硬化指数计算公式为：[（1×N1+2×N2+3×N3+4×N4）/每张切片肾小球总数]×100%，式中N1代表1级损害肾小球个数，…N4为4级损害肾小球个数。
2结果2.1尿蛋白变化7wk末模型组和各干预组大鼠尿蛋白开始升高，B组，C组，D组24h尿蛋白量（mg/24h）分别为39.0±6.4，31.2±5.5，62.8±10.4，正常对照组为0.9±0.4，随着时间的推移，肾病组大鼠尿蛋白量逐渐增加，19wk末达到高峰，而干预组大鼠尿蛋白量趋于平稳，整个实验期间模型组尿蛋白量始终大于治疗组。2.2各组大鼠血清BUN与Cr的变化模型组大鼠在19wk末血清BUN与Cr浓度明显升高，与A组相比差异有统计学意义（P=0.000）。各干预组大鼠直到27wk末血清BUN和Cr浓度才有显著性升高，与模型组相比，差异有统计学意义。
3讨论各种原因引起的慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰竭，其实质是肾脏纤维化和硬化。大量研究表明，TGFβ是介导肾小球硬化的共同通路，是ECM沉积、肾纤维化进展的重要调节因子，在调节细胞外基质代谢、参与炎症反应、间质纤维化等方面起重要作用，然而其确切的作用机制至今尚未阐明。Smads家族的发现为促进TGFβ信号通路的认识和作用机制的阐明提供了重要的理论依据。目前国内外对于TGFβ/Smads信号转导通路在肾小球硬化发生中作用的研究还甚少报道。Smads蛋白在调节TGFβ细胞内信号传导中起重要作用。Smads介导TGFβ超家族受体到核基因的信号传递，与其分子结构特点密切相关。根据其结构和功能的不同分为三类：受体调节性Smads（receptor regulated smads，RSmads），主要包括Smad1，2，3，5，8，9；通用Smads（common Smads，CoSmads），主要包括Smads4；抑制性Smads（inhibitory Smads，ISmads），主要包括Smad6，7。TGFβ与其受体结合后，其Ⅰ型受体磷酸化并激活RSmads，后者与CoSmads形成复合物进入核内调节靶基因的转录。TGFβ可诱导内源性Smad7的表达，而Smad7通过与TGFβ1Ⅰ型受体稳定结合阻止了RSmads的磷酸化激活，从而负反馈调节TGFβ信号传导系统。本研究是在前期工作的基础上采用分二次尾静脉注射阿霉素的方法构建慢性进行性肾脏损害的动物模型，结果发现，模型组尿蛋白增加，血清BUN，Cr升高，形态学呈现肾小球硬化改变，说明肾硬化模型制备成功。与模型组相比，各干预组尿蛋白排泄量均明显减少，血BUN，Cr升高较晚（B组，C组直到27wk才开始升高），肾小球系膜增生及硬化程度明显减轻，说明OM能明显改善阿霉素肾病鼠的尿蛋白水平及肾功能，抑制肾小球系膜增生及硬化，明显延缓肾小球硬化的病理进程。实验发现OM100mg/（kg？d）的疗效优于50mg/（kg？d），其肾脏保护作用是否有剂量依赖性有待于增加不同浓度组进一步研究。本研究还发现模型组随着肾纤维化的进展，TGFβ1，Smad1，2，3，5蛋白的表达逐渐增加，而Smad7蛋白的表达逐渐减少，推测Smad1，2，3，5蛋白的表达增加及Smad7蛋白的表达减少可能为TGFβ1引起纤维化进程进展的主要原因。与模型组相比，各干预组TGFβ1，Smad1，2，3，5表达减少，而Smad7的表达增加，考虑OM抗肾纤维化的作用可能与干预TGFβ1/Smads信号传导通路有关。