翘嘴鳜?斑鳜杂交子代F1及其自交子代F2胚胎发育的研究及鉴定

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摘要：利用人工催产、人工授精的方法获得翘嘴鳜（Siniperca chuatsi） （）×斑鳜 （Siniperca scherzeri）（）杂交子代f1及F1 的自交子代F2，并对翘嘴鳜、斑鳜及其杂交后代F1和F1自交后代F2的胚胎和胚后发育进行了初步观察与比较，并采用SSR分子标记方法对翘嘴鳜、斑鳜及其正交子代F1进行了分子鉴定。结果表明，翘嘴鳜卵径为（1.09±0.05） mm，正交F1雌鱼卵径为（1.26±0.05）mm、f2卵径（1.19±0.04） mm，显著小于斑鳜的卵径（1.83±0.09） mm （P< 0.05）。翘嘴鳜受精卵在水温23.4～25.1 ℃经过46 h孵化破膜，F1受精卵在水温23.1～24.8 ℃经过49 h 孵化破膜，F2受精卵在22.6～24.5 ℃经过51 h孵化破膜，斑鳜受精卵在水温 23.5～25.7 ℃经过107 h孵化破膜。翘嘴鳜、斑鳜、F1和F2初孵仔鱼大小分别为（4.06±0.50） mm、（4.58±0.30） mm、（4.21±0.30） mm和（4.14±0.20） mm。采用SSR分子标记方法，根据DNA带型的不同可以成功鉴别出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子F1。

关键词：翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）;斑鳜（Siniperca scherzeri）;杂交;微卫星;鉴定

中图分类号：S917.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4920-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2014.20.039

Identification of Embryonic Development Hybrids F1 of Siniperca chuatsi （） × Siniperca schezeri （） and Its F2

YUAN Yong-chao1， LIANG Xu-fang1，TIAN Chang-xu2，YAN Wei2， CAI Wen-jing2，DOU Ya-qi1，YI Ti-lin1

（1.College of Fisheries/Key Lab of Freshwater Animal Breeding，Ministry of Agriculture/Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation

Center of Hubei Province， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China;

2.Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract： Embryonic and post-embryonic developments were observed and compared in mandarinfish Siniperca chuatsi， spotted mandarinfish Siniperca schezeri and its hybrids F1 and F2 induced to spawn and artificially fertilized at room temperature. The embryonic development of hybrids of Siniperca chuatsi × spotted mandarinfish Siniperca schezeri and their hybrids F1 and F2 were described and compared with each other and their parents. The results showed that in diameter the eggs of spotted mandarin fish （1.83±0.09） mm were larger than that of the hybrids F1 [（S. chuatsi （） × S. schezeri （）] （1.26±0.05） mm， hybrids F2 （1.19±0.04）mm and the mandarin fish （1.09±0.05）mm. The embryos of the mandarin fish， F1 and F2 were hatched in about 46 h at 23.4～25.1 ℃， 49 h at 23.1～24.8 ℃， 51 h at 22.6～24.5 ℃ while the embryos of the spotted mandarinfish were hatched in about 107 h at 23.5～25.7 ℃. Newly hatched mandarin fish， spotted mandarin fish， F1 and F2 larvae were （4.06±0.50） mm， （4.58±0.30） mm， （4.21±0.30） mm， and （4.14±0.20） mm in length， respectively. It is indicated that SSR markers can discriminate well mandarin fish， spotted mandarin fish， and its hybrids.

Key words： Siniperca chuatsi; Siniperca schezeri; hybrid; microsatellite; identification

翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）和斑鳜（Siniperca scherzeri）同隶属于鲈形目鳜亚科鳜属。翘嘴鳜和斑鳜肉味鲜美、营养丰富，是我国传统的淡水养殖名贵鱼类。翘嘴鳜生长速度快，容易发生病害[1，2]，制约了翘嘴鳜养殖业的发展。自1994年以来，广东省每年鳜暴发性流行病发病率达60%，死亡率为20%～30%。斑鳜是珠江流域的经济鱼类[3]，其肉质鲜美、病害少，但其个体较小，生长速度慢。杂交不仅能丰富遗传结构，还能使亲本的优良性状得到结合，提高杂交后代的生长性能[4]。翘嘴鳜和斑鳜的生物学特性和人工繁殖均有报道[5-9]，研究表明杂交鳜能遗传亲本的某些优良生长性状[10-13]。翘嘴鳜和斑鳜的杂交子代能够表现出较好的养殖性能及生长性能。翘嘴鳜、斑鳜和杂交子代形态相似，在育种过程别是育苗阶段和亲本选择阶段，传统的形态学鉴别方法很难准确地辨别纯种和杂交种，因此容易造成种质混杂。

微卫星又称简单重复序列，均匀分布于真核生物基因组中，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，具有等位基因数目多、重复性好、共显性遗传等特点，被广泛应用于物种鉴定和基因定位等研究。本研究中对翘嘴鳜和斑鳜的正交子代F1，F1自交子代F2的胚胎发育及胚后发育进行了观察，并对翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子代进行了分子鉴定，解决了水产养殖中杂交鳜（翘嘴鳜和斑鳜的杂交子一代）鉴定难和种质混杂的问题，以期为鳜鱼及其杂交子代的鉴别提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用翘嘴鳜、翘嘴鳜幼体和斑鳜性成熟个体购自于麻城市中和水产开发有限公司渔场和辽宁省辽阳市辽阳县兴大养殖场。

试验于2011年6月和2013年5月在麻城市中和水产开发有限公司渔场进行。正交子代[S. chuatsi（）× S. scherzeri（）]为不同野生亲本的人工繁殖子一代，均分批采自麻城市中和水产开发有限公司渔场。

1.2 人工催产

在2011年和2013年繁殖季节，通过外源药物诱导，对翘嘴鳜和斑鳜亲鱼及其杂交子代F1亲本进行人工催产及人工授精，获得质量较好的受精卵。

1.3 胚胎发育观察

对翘嘴鳜和斑鳜胚胎及其杂交子代F1和F1自交子代F2的胚胎发育进行观察，每隔2 h测量1次水温;对翘嘴鳜和斑鳜及其杂交子代F1和F1自交子代F2孵出的仔鱼进行胚后发育观察，仔鱼孵出初期，每隔4 h观察1次，每次随机抽取10尾鱼。中后期根据发育情况逐渐延长取样时间间隔，以50%个体出现新特征作为划分发育时期的标准，直至8日龄。

1.4 基因组DNA的提取

33尾鳜鱼（翘嘴鳜亲本11尾，斑鳜亲本10尾，翘嘴鳜和斑鳜的正交子代F1 12尾）从麻城市中和水产开发有限公司渔场采得。部分样本剪少量新鲜尾鳍条，保存于95%乙醇中。利用DNA提取试剂盒从鳍条组织提取基因组DNA，并用紫外分光光度计检测DNA浓度。

1.5 SSR分析

以提取的待测样品基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCR）扩增出DNA目的片段，用于PCR扩增反应的一对微卫星引物序列为：上游引物：5′-ATGTAACCGTAAGTGACCTC-3′;下游引物：5′-TGTTGTTCAGACGATGACGA-3′。

PCR反应体系为10×PCR Buffer 2.5 μL， 25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，1.0 mmol/L dNTPs 2.5 μL，上、下游引物各2.0 μL，模板DNA 50～100 ng，Taq DNA聚合酶（5 U/μL ）0.2 μL ，补ddH2O至25 μL。PCR反应程序为94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min，反应结束后于4 ℃中保存。将PCR产物以8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，常规银染法染色后，拍照记录电泳结果。

2 结果与分析

2.1 翘嘴鳜、斑鳜及杂交子代F1胚胎发育

以翘嘴鳜为母本，斑鳜为父本的正交子代F1及F1自交子代F2鱼卵均为非黏性卵，呈淡黄色且透明，在流水中呈漂浮性。受精卵大多数具有1个大油球，有些卵具有数个油球，最多达8个。正交子代F1卵子直径为（1.26±0.05） mm;F1自交子代F2卵子直径为（1.19±0. 04） mm;翘嘴鳜卵子直径为（1.09±0.05） mm;斑鳜卵子直径为（1.83±0.09） mm。

2.2 翘嘴鳜、斑鳜及杂交子代F1的仔鱼形态特征

以翘嘴鳜为母本，斑鳜为父本的正交子代F1刚孵出的仔鱼卵黄囊较大，全身透明，可清晰见到血液流动。正交子代F1刚孵出的仔鱼全长为 （4.21±0.30） mm;F1自交子代F2刚孵出的仔鱼全长为（4.14±0.20） mm;翘嘴鳜刚孵出的仔鱼全长为 （4.06±0.05） mm;斑鳜刚孵出的仔鱼全长为 （4.58±0.30） mm。翘嘴鳜、斑鳜及其交杂交子代F1胚后发育形态特征见表1。

2.3 翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子代F1的SSR带谱

采用SSR分子标记方法来鉴别翘嘴鳜、斑鳜及其正交子代F1（图1）。翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子代F1扩增出3种不同的DNA带型：第一种带型为翘嘴鳜，在105 bp处扩增出1条特异性DNA条带;第二种带型为杂交子代F1，在105 bp和120 bp处各扩增出1条特异性DNA条带;第三种带型为斑鳜，在120 bp处扩增出1条特异性DNA条带。根据DNA带型的不同即可鉴别出翘嘴鳜、斑鳜及其杂交子代F1。

3 小结与讨论

本研究中，正交子代F1胚胎发育时序特征与翘嘴鳜基本相同，在水温为23.1～24.8 ℃下，胚胎发育约需经过49 h。F1自交子代F2受精卵在22.6～24.5 ℃经过51 h。这与其他鳜类研究结果基本相似，如翘嘴鳜胚胎半数孵化需时34 h （ 27.2 ℃）[5]; 鸭绿江斑鳜受精后60 h到心跳期，孵化需时约144 h （ 22.2～25. 2 ℃）[14]; 碧流河水库斑鳜受精后44 h到心跳期，孵化需时约146 h（ 19.0～23.5 ℃）[15]。然而斑鳜与翘嘴鳜虽然同为鳜属，但其胚胎发育时序却不相同。

研究表明，杂种后代的性状一般偏向于母本，即母本对后代基因有较大的影响力。本研究中在外部条件基本相同的情况下，以翘嘴鳜为母本的杂交鳜胚胎发育时序均以母本为基准，说明卵细胞在胚胎发育过程中对胚胎发育时序、胚胎大小起到了决定性的作用，这可能是卵细胞中的细胞质对生物遗传性状有明显的母性遗传作用的原因。由此可见，在自然选择和人工选择的共同作用下，双亲对后代群体的遗传贡献是不均等的[16]。宓国强等[11]利用传统形态学和框架分析法分析，发现翘嘴鳜和斑鳜的杂交子代的形态性状偏向母本;三角鲂（Megalobrama terminalis）和团头鲂（M. amblycephala）的正、反交杂交后代形态性状也存在一定的母性效应[17]。虹鳟Oncorhynchus mykiss（）×山女鳟Oncorhynchus masou（）杂交F1受精卵与母本的胚胎发育积温相当[18]。牙鲆Paralichthys olivaceus（）×圆斑星鲽Verasper variegatus（）杂交胚胎的发育过程也与母本相似[19]。

SSR分子标记由于具有高度多态性、共显性的孟德尔遗传方式以及数目巨大且随机分布的特点，被广泛应用到性状分析、群体遗传分析、进化和种质鉴定等研究中[20]。在利用SSR分子标记进行种质鉴定方面，Jenneckens等[21]用湖鲟LS39引物扩增10种鲟微卫星位点，该位点在闪光鲟上独有且仅有1个110 bp的等位基因，从而与其他9种鲟区分开。Beacham等[22]应用13个微卫星位点区分了环太平洋区不同区域种群的大麻哈鱼（Oncorhynchus tshawytscha）。微卫星是以1～6个核苷酸为基本重复单元的串联重复序列，其本身重复单元数的变异是物种具有遗传多态性的基础[23]。对于个体而言，某一微卫星位点的等位基因数是和该生物的染色体倍性相关的。一般地，对于一个普通二倍体生物个体，由于引物是针对特异的微卫星位点设计的，因而每对引物在杂合个体中只能扩增出2条目的条带，在纯合个体中只能扩增1条目的条带[24]。

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