硫酸化茯苓多糖的研究进展
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇硫酸化茯苓多糖的研究进展范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
茯苓(Poria cocos)是我国传统的名贵中药材,主产云南(云苓)、安徽(安苓)、贵州、广西、湖北、福建(闽苓)等地,为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核,属担子菌纲真菌,具有渗湿、健脾、利尿等功能。茯苓多糖为我国传统中药茯苓的主要有效成分,可用于医疗、保健等领域,具有广阔的开发应用前景。为进一步优化茯苓多糖的提取工艺,促进其开发应用,文章参考大量国内外文献,对近几年茯苓多糖的提取、纯化及其应用作一综述。
1茯苓多糖的化学组分
众多文献报导β-D-(1-3,1-6)葡聚糖有显著的调理或增强人体免疫功能,但由于高分子量和复杂的高级分子结构,一些多糖的水溶性很差,只有对这些多糖进行结构修饰和改造才可以更好地利用它们。Chihara等[1]通过Smith降解除去β-1,6分支,将β-茯苓聚糖转化成β-茯苓多糖(Pachymaran),对实体瘤S180的抑瘤率从0提高到88％。Hamuro等[2]采用液固相振荡半合成工艺,制取了羧甲基茯苓多糖(Carboxymethylpachymaran,CMP),水溶性得到很大改善,动物试验的结果表明,CMP抗肿瘤作用较强。将天然多糖进行硫酸酯化修饰也是多糖结构改造的一个研究热点,多糖硫酸化后可以增强原有的生物活性或产生新的功能。
茯苓多糖主要存在于茯苓细胞壁中,按照溶解度的不同又分为水溶性茯苓多糖和碱溶性茯苓多糖。通常采用水提醇沉法、碱提醇沉法提取。
2.1 水提醇沉法
称取20g茯苓粉末10～20倍热水(95℃)浸提抽滤滤液减压浓缩(浸提液∶浓缩液=10∶1)4倍体积的95%乙醇沉淀(含醇量达80%)于冰箱中静置过夜离心沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤真空干燥得茯苓多糖粗品。该法采用水作为溶剂,具有价廉、无毒、操作安全等优点,其缺点是浸提时间长且提取率较低。
2.2 稀碱浸提法
稀碱法浸提碱溶性茯苓多糖应注意,在提取结束后应迅速用醋酸中和,以免多糖活性受影响。称取20g茯苓粉,分3次溶于总共为10倍体积的0.5MNaOH中,每次4℃浸提多糖8h,合并3次浸提上清液,10％醋酸中和至pH6～7,4℃冰箱中沉淀过夜。低温离心收集沉淀,去离子水洗涤沉淀3次,无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤,70℃干燥得白色茯苓多糖,研成粉末待用。
该法提取率较水提醇沉法高,但浸提程序较繁琐,浸提条件较剧烈,极易破坏多糖的立体结构,使其生物活性受到限制。
2.3 茯苓多糖的纯化
将DEAE-650C层析柱水平衡后,取200mg精制多糖样品溶解于蒸馏水中上样, 蒸馏水洗脱60mL后,以0～3mol·L-1NaCl溶液梯度洗脱,流速1·0mL·min-1,每管收集2mL,分布收集、备用。然后用硫酸-苯酚法检测多糖含量,具体操作如下。
硫酸-苯酚显色液的配制:用50mL浓硫酸和10mL水配制实验用硫酸溶液,并加入0.6g苯酚,配制成显色液。
显色方法:移取1.00mL待测样品于试管中,加入5.00mL显色液,振荡混匀。置于沸水浴中保温30min,立即置于冷水浴中, 冷却至室温。以未加葡萄糖溶液作为空白对照。于490nm处测定系列葡萄糖溶液的吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。测定样品溶液490nm 处吸光度,据标准曲线计算多糖含量。
3硫酸化多糖的生物活性研究
硫酸化多糖具有独特的生物活性,主要表现在抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等方面。
3.1 硫酸化多糖的抗病毒活性
抗病毒活性是硫酸化多糖最显著的活性,许多经硫酸酯化的多糖,如香菇多糖、地衣多糖、右旋糖杆、裂褶菌多糖、木聚糖、箬叶多糖的硫酸酯有明显的抑制HIV-1(Human Immune Efficiency Virus Type1)活性,其作用机理是干扰HIV-1对宿主细胞的粘附作用,抑制逆转录酶的活性等。抗病毒硫酸酯化多糖的硫酸根取代度在1.5～2.0为最佳,如果将这些多糖的硫酸根除去,则上述活性随之消失。
Nakashima等人从海洋红藻Schizymenia pacifica分离到一种分子量大约为2×106Da的硫酸化多糖,含73%的半乳糖,20%的硫酸基,红外光谱和水解产物的分析表明这是一种γ-角叉菜胶。体外实验表明,该复合物能显著抑制逆转录酶的活性,在2×103 抑制单位/mL的浓度下可抑制92%的反转录酶活性。该抑制活性是特异性的,对正常细胞的生长没有影响。
3.2 硫酸化多糖的抗凝血和抗血栓活性
肝素和低分子肝素是硫酸化多糖抗凝血活性的代表,目前已经广泛应用于临床实践。低分子肝素是商品肝素降解的衍生物,平均分子量为4～8kD,糖基数13～22个。现在已知,肝素抗凝作用主要是靠与ATⅢ和凝血因子Ⅱa形成三元复合物,使ATⅢ能有效灭活凝血酶。肝素的作用一方面有赖于分子中大量的负电荷,另外,其松散的构象有利于与蛋白质或细胞表面位点匹配结合。肝素可与许多血浆蛋白、血小板及血管壁基质蛋白结合。如果采用化学方法去除其分子上的硫酸基团,则其体外抗凝作用降至2%以下。
对褐藻多糖硫酸酯的活性研究表明,其各组分均具有抗血小板活化因子的作用,其效应与浓度称正比,与硫酸根的含量也有正比关系。Alban等用硫酸化Curdlan的产物CurS进行抗凝血实验,发现CurS抗凝血模式不同于肝素。CurS通过抑制FXa的形成而减少凝血酶的产生,加速HCII(heparin cofactor II)介导的凝血酶的失活,阻止凝血酶介导的纤维蛋白多聚物的形成,而它的AT介导的抗凝血酶活性要比肝素低得多。Buchanan硫酸化硫酸皮肤素空间特异位点获得低分子量、高溶解度的产物Intimatan,实验证明是HCII的有效激动剂,其抗凝和抗血栓效果优于硫酸皮肤素和肝素。Mourao等从棘皮动物海黄瓜中分离出一种硫酸化多糖(Fucosylated chondroitin sulfate),和哺乳动物的硫酸软骨素有一样的骨架结构,但一些葡萄糖醛酸残基上有硫酸化的岩藻糖分支。正是这种分支赋予该多糖高抗凝活性。这种多糖的抗凝活性和抗凝机制均不同于具有相似取代度的肝素和硫酸化的岩藻聚糖,这种差异来自于多糖空间结构的差异。
3.3 硫酸化多糖的抗肿瘤活性
利用海藻多糖硫酸酯进行的抗癌实验显示,海藻多糖硫酸酯能抑制小鼠体内Lewis肺癌的生长,抑瘤率可达65.41%以上;体外能抑制A549肺癌细胞的生长,抑制率大于55.56%;流式细胞仪检测到典型的细胞凋亡峰。
从海藻中提取得到的硫酸化多糖如聚古罗糖酯(912),平均相对分子量为6kD。体内实验结果表明,912能显著抑制小鼠体内S180肉瘤的生长;体外实验结果表明912对ts-FT210(温度敏感型大鼠乳腺癌细胞)增殖的抑制作用能达到63.69%以上。由于912对正常细胞及其他大多数肿瘤细胞均无明显的抑制作用,说明其具体的作用机理是通过细胞周期和蛋白抑制发挥作用,而传统的细胞毒药物是通过诱导凋亡机制发挥作用。这与一般的多糖通过增强机体免疫功能而发挥抗肿瘤活性也不相同。
体外实验表明,在样品浓度为2.5mg/kg时,硫酸化茯苓多糖对肺癌细胞的抑制率为16.2%,与顺铂合用,能显著降低顺铂对肺癌细胞的IC50值。从灰树花发酵菌丝体分离获得的水不溶性多糖经硫酸化后得到的灰树花硫酸酯,在体外对S180无抑制活性,但对人胃癌细胞SGC-7901有直接杀伤作用。
硫酸化多糖抗肿瘤的途径既有较为普遍的增强机体免疫功能,也有通过对细胞周期和特异蛋白表达的抑制及抑制肿瘤诱导的血管生成。
3.4 硫酸化多糖的抗动脉粥样硬化
动脉粥样硬化的发生、发展是一个十分复杂的病理过程,它涉及到血管内皮细胞、平滑肌细胞、炎性细胞(如单核细胞、巨噬细胞)、淋巴细胞、血小板等多种细胞及相关因子。许多研究发现硫酸化多糖与动脉粥样硬化存在密切的关系。大多报道表明硫酸化多糖可保护血管内皮细胞免受各种刺激因子的损伤作用,从而阻断动脉粥样硬化形成的起始环节;另外,硫酸化多糖也可以通过抑制血管内皮细胞的增殖、迁移,减少炎性细胞、淋巴细胞、血小板等黏附、聚集到血管内膜,抑制补体的激活等多种途径来达到抗动脉粥样硬化的目的。
4前景展望
相信随着多糖研究方法的不断改进和多糖制药工艺的进一步提高,随着多糖分离、提纯、糖合成化学以及糖生物学、医学研究的不断深入,多糖硫酸化技术必将得到进一步改善,茯苓多糖将会具有更加广阔的市场。
参考文献
[1] polysaccharide derived Chemically from Natural Glucan (Pachyman)．Nature, 1970:225,943～944.
[2] Donzelot,E.Kaufmann,H.Dauzier G. Biological and clinical study of a synthetic heparinic substance:dextran sulfate．Sem Hop,1955,30;31(26): 1475～1480.
[3] Hamuro,J.Yamashita,Y.Ohsaka;Y. Carboxymethylpachymaran,a new water sChihara,G.Hamuro,J.Maeda,Y. Arai,Y.Fukuoka,F.Antitumour oluble polysaccharide with marked antitumor activity．Nature,1971,233:486～488.
[4] Zeerleder,S.Mauron,T.Lammle,B. Wuillemin,W.A.Effect of low-molecular weight dextran sulfate on coagulation and platelet function tests． Thromb.Res,2002,105:441～446.
[5] Alban,S.Franz,G.Characterization of the Anticoagulant Actions of a Semisynthetic Curdlan Sulfate．Thromb．Res, 2000,99:377～388.
[6] Amornrut,C.Toida,T.Imanari,T. Woo,E.R.Park,H.Linhardt,R.Wu,S.J.Kim,Y.S.A new sulfated β-galactan from clams with anti-HIV activity．Carbohydr．Res,1999,321:121～127.
[7] Yang,X.B.Gao,X.D.Han,F.Tan, R.X.Sulfation of a polysaccharide produced by a marine filamentous fungus Phoma herbarum YS4108 alters its antioxidant properties in vitro． Biochimica et Biophysica Acta,2005, 1725:120～127.
[8] 陈炅然,胡庭俊．硫酸多糖抗病毒作用研究进展[J]．动物医学进展,2005,26(4):54.
[9] Mituya,H.Looney,D.J.Kuno,S．et al．Dextran sulfate suppression of virus in the HIV family:inhibition of virion binding to CD4+ cells.Sci,1988,240: 646.
[10] 周靓,蒙义文.多糖及其衍生物抗病毒作用研究进展[J]．应用与环境生物学报,1997,3(1):82.
[11] 冯仁田,王福清．低分子量肝素的作用机制及其临床研究进展[J]．中国生化药物杂志,1998,19(5):217.
[12] 苗本春,李静,耿美玉,等．海洋硫酸多糖聚古罗糖酯(912)抗肿瘤作用机理探讨[J]．中国海洋药物,2003(3),11.
[13] 胡金凤,耿美玉,张均田．硫酸多糖与动脉粥样硬化[J]．中国药理学通报,2001,17(2):127.
[14] 邓成华,杨祥良,王雁,等．取代度对硫酸酯化虎奶多糖抗氧化活性的影响[J]．华中理工大学学报,2000,28(5):104.