紫苏RAS基因启动子的克隆及序列分析
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摘要：迷迭香酸合成酶（Rosmarinic acid synthase，RAS）是紫苏（Perilla frutesc
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2 结果与分析
参考紫苏RAS基因的cDNA序列，通过PCR反应获得RAS基因的全长DNA序列（图1），以测序得到的序列信息，设计用于基因组步移的特异性引物。序列分析发现紫苏RAS基因是一个无内含子基因（Intron-free gene），与已报道的从香蜂草（Melissa officinalis）中克隆得到的RAS基因结构相似[11]。
基因组DNA（图2a）经DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ、StuⅠ 4个限制性内切酶消化后（图2b），经过纯化、连接Adaptor后作为模板，与引物RAS-GSP1和AP1进行Outer PCR扩增反应，结果如图2c所示。在7号泳道（EcoRⅤ酶切构建文库）出现了一条暗的条带，以其作为模板，并以RAS-GSP2和AP2为引物进行Inner PCR反应，得到了大小为2 000 bp的片段，如图2d所示。将PCR产物切胶回收并进行TA克隆后，送至宝生物工程（大连）有限公司测序，得到长度为2 022 bp的5′侧翼区序列。
2.3 紫苏RAS基因启动子的序列分析
利用Neural Network Promoter Prediction对RAS基因启动子进行转录起始位点预测，发现在 1 918～1 968 bp处序列为：5′-AAAATTATAGTATA AGAGGGGCAAAATGGGTAATTCAGGTGGAATAAA TA-3′存在转录起始位点，预测的转录起始位点碱基为位于1 958 bp处的G，其可能性为97%。启动子序列除含有多个启动子必需的CAAT-Box和TATA-Box外，还有与激素、光照和环境因素等相关的调控元件（图3）。各元件在序列中的详细信息见表1。
3 小结与讨论
植物的生长发育受基因的调控，基因调控可分为基因结构活化、转录水平调控、转录后水平调控、翻译及翻译后水平调控等，从调控效果来看，最为有效的调控方式是转录水平调控。研究发现，转录水平调控主要涉及启动子、转录因子和RNA聚合酶3种因素的相互作用，其中最为主要的调控元件是启动子，对基因启动子的分离与功能的解析能更好地了解基因表达的调控机制，并可以进一步采用基因工程手段实现目的基因的高效表达[14]。
目前，植物启动子的研究和应用已取得了重大进步，并已成功分离多种植物中的启动子序列[15-17]。RAS是紫苏迷迭香酸生物合成途径中的关键酶，迄今未见其启动子的研究报道。本研究利用基因组步移技术，从紫苏基因组DNA中获得了RAS基因的5′端2 022 bp的侧翼序列，推测的转录起始位点G（定义为+1）位于起始密码子上游67 bp处。通过PlantCARE在线分析，发现距离转录起始位点最近的TATA-box，位置与其在真核生物基因中的通常分布情况相一致。该启动子序列含有真核生物典型的核心启动子区域，并含有众多应答激素和胁迫信号的顺式作用元件，如脱落酸响应顺式元件（ABRE），赤霉素响应元件（GARE-motif），干旱诱导相关MYB结合位点（MBS）和植物生长素响应元件（TGA-element）等。在植物的生长发育过程中，光作为一种重要的信号调控相关基因的表达，常见的受光调节启动子中的顺式作用元件有3-AF1 binding site、AE-Box、GA-motif、GAG-motif、G-Box、I-box、Sp1和TCT-motif等，其中I-box更是单子叶和双子叶植物中很多光调控基因启动子所具有的、带有重要功能的调控元件[18]。本研究发现在RAS基因启动子序列中含有3-AF1 binding site、G-Box、I-box和Sp1光应答原件，能够调节其受光诱导后的转录活性。另外，在启动子中存在茉莉酸甲酯（MeJA）响应的顺式作用元件（CGTCA-motif），表明RAS基因的表达受到茉莉酸甲酯的诱导，这与之前报道的MeJA在一定程度上可以上调RAS基因的转录水平相一致[13]。
综上所述，紫苏RAS基因启动子序列中具有的多种响应元件说明其表达可能受到干旱、光胁迫以及茉莉酸甲酯、脱落酸、赤霉素等环境因素的影响，但是由于生物基因表达调控的复杂性，所预测的启动子顺式作用元件是否与预测的功能完全一致还有待进一步验证和分析。为此，后续将采用启动子缺失等方法对其功能和结构域开展研究，并进一步通过构建嵌合启动子为紫苏的定向育种提供参考依据。
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