RP-HPLC法测定三九胃泰颗粒中两种黄酮类成分的含量
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摘 要 目的：对三九胃泰颗粒中的2种主要黄酮类成分5，7，3’，4’-四甲氧基黄酮(Ⅰ)和 5，7，3’，4’，5’-五甲氧基黄酮(Ⅱ)进行含量测定。方法：采用反相高效液相色谱法，使用ZORBAX Extend C18柱(250mm×4．6mm，5μm)，流动相为甲醇-水梯度洗脱（0～18 分钟为35:65，19～22分钟为0:100），流速1．2ml/分，检测波长337nm，柱温25℃。结果：化合物Ⅰ、Ⅱ进样量在0．4～4．0μg范围内均有良好的线性关系，相关系数r均为0．9999（N=6）；化合物Ⅰ、Ⅱ的平均回收率（N=6）分别为100．6%和102．6%，RSD分别为1．02%和1．09%。结论：本方法能够准确地测定三九胃泰颗粒中的2种主要黄酮类化合物的含量，其测定结果可为三九胃泰颗粒质量控制提供新的依据。
关键词 三九胃泰颗粒 黄酮 rp-hplc 含量测定
三九胃泰颗粒处方由三桠苦、黄芩、九里香、两面针、木香、茯苓、白芍、地黄共八味中药组成，其中九里香为主要药材。我们从九里香分离得到两种主要的甲氧基黄酮类成分，经NMR等波谱学手段，鉴定它们分别是5,7,3’,4’-四甲氧基黄酮（即九里香酮）和 5,7,3’,4’,5’-五甲氧基黄酮，并采用HPLC法测定了这两种化合物在三九胃泰中的含量。由于三九胃泰部颁标准中含量测定项下仅有黄芩苷含量测定，因此本实验的研究结果为三九胃泰颗粒的质量全面控制提供新的依据。
资料与方法
仪器与材料：Agilent 1100高效液相色谱仪，VWD检测器，Agilent 1100色谱工作站。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水。电子天平为Mettlertoledo AG135型。三九胃泰颗粒为市售成药，共11批次，购自长春市吉林大药房。
化合物Ⅰ、Ⅱ的对照品均为自制，系从九里香叶提取物中分离得到，并经1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光谱鉴定其结构；按本方法色谱条件，归一化测得纯度分别为98．2%和99．8%。
色谱条件：ZORBAX Extent C18柱(250mm×4．6mm，5μm)，柱温25℃，流动相为甲醇-水梯度洗脱（0～18分钟为35:65，19～22分钟为0:100），流速1．2ml/分，检测波长337nm，进样量20μl。
方法学考察：线性关系考察；精密度试验；重复性试验；加样回收率试验，结果化合物Ⅰ、Ⅱ平均回收率（N=6）分别为100．6%（RSD为1．02%）、102．6%（RSD为1．09%）；稳定性试验。方法学考察结果均满足相关要求。
含量测定：对照品溶液制备：精密称取化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的对照品各4．0mg，置同一100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
供试品溶液制备：取10个不同批号的三九胃泰颗粒，每个批号取3袋，混合均匀，精密称取40g，分别用甲醇超声提取3次，每次加甲醇100ml，超声时间分别是1小时，合并提取液，蒸干溶剂，加甲醇溶解并定容至25．0ml，过0．45μm微孔滤膜，制得供试品溶液。
样品的测定：分别取上述对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算样品中化合物Ⅰ、Ⅱ的含量。
结 果
测得的10批样品结果，见表1。
讨 论
测定波长的选择：紫外光谱图显示化合物Ⅰ、Ⅱ皆在337nm附近有最大吸收，故选定337nm为测定波长。
流动相选择：分别采用乙腈-水、甲醇-水作为流动相，发现前者不能使所测化合物与样品中其他成分达到基线分离，而前者的分离效果较好，故采用甲醇-水为流动相。此外，为将样品中的其他成分在一个分析周期内从色谱柱中洗脱出来，采用了梯度洗脱的方式，在所选色谱条件下，待测的2种化合物均达到基线分离。
本文考察了提取溶剂，通过HPLC测定，比较了水、甲醇、乙醇和氯仿，结果以甲醇的提取率最高，水的提取率最低；通过对甲醇室温冷浸24小时、回流提取1小时、超声提取1小时提取率的比较，发现回流提取率最高。而回流提取3次和4次的提取率基本一致，最终确定每次加入甲醇量为15ml，回流时间均为1小时即可使提取率达到最高。
小结：本测定方法可以准确、便捷地测定三九胃泰颗粒中黄酮类成分，化合物Ⅰ、Ⅱ能达到基线分离，重复性及回收率较好，结果可靠。各批次的三九胃泰中5，7，3’，4’，-四甲氧基黄酮（G）和5，7，3’，4’，5’-五甲氧基黄酮（H）的含量基本稳定，平均值分别为24μg/g和20μg/g。本文的研究结果可为三九胃泰颗粒质量控制提供了新的依据。
参考文献
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