基于GC TOF MS研究威灵仙总皂苷对佐剂性关节炎大鼠血清代谢谱的影响
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[摘要] 观察威灵仙总皂苷（TSCR）对佐剂性关节炎（AA）大鼠血清代谢谱的变化，探讨其治疗AA可能的作用机制。采用弗氏完全佐剂诱导AA大鼠模型，观察大鼠的组织病理学变化。利用气相色谱飞行时间质谱（GCTOFMS）结合主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLSDA），对正常组、AA模型组和TSCR组3组之间的代谢谱进行分析，通过变量重要性投影（VIP）>1结合P
[关键词] 佐剂性关节炎； 威灵仙总皂苷； 代谢组学； 气相色谱飞行时间质谱； 血清
Effect of total saponins of Clematidis Radix et Rhizoma on serum
metabolic profile in adjuvant arthritis rats based on GCTOFMS
LIU Qing1， WANG Yongzhong 2*， JIANG Hui2 ， HAN Yanquan2， LI Yuxin1
（1 School of Pharmacy， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；
2The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine， Grade 3 Laboratory of Traditional
Chinese Medicine Preparation， State Administration of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230031， China）
[Abstract] To observe the effect of total saponins of Clematidis Radix et Rhizoma （TSCR） on serum metabolic profile changes in adjuvant arthritis（AA） rats， and explore its possible action mechanism for AA rats The AA rat models were induced by Freund's complete adjuvant（FCA）， and their histopathological changes were observed Gas chromatographytimeofflight mass spectrometry （GCTOFMS）， principal component analysis（PCA） and partial least squaresdiscriminant analysis （PLSDA） were employed to analyze the metabolic profile among normal group， AA model group and TSCR group Potential biomarkers in the serum were screened based on the variable importance projection（VIP） value>1， P
[Key words] adjuvant arthritis； total saponins of Clematidis Radix et Rhizoma； metabolomics； gas chromatographytimeofflight mass spectrometry（GCTOFMS）； serum
doi：10.4268/cjcmm20161225
威灵仙总皂苷（total saponins of Clematidis Radix et Rhizoma，TSCR）是从威灵仙中提取的有效部位，具有调节免疫、抗炎镇痛等作用[1]。类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性关节炎症为主要表现的自身免疫疾病[2]。代谢组学（metabonomics）是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后，系统研究病理生理刺激后代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质和药物作用机制的一种全新的组学技术[34]。课题组前期研究表明TSCR对佐剂性关节炎大鼠具有较好治疗作用[5]，因此，本实验从代谢组学的角度，应用气相色谱飞行时间质谱（gas phase chromatographytimeofflight mass spectrometry，GCTOFMS）技术，研究TSCR干预后佐剂性关节炎模型大鼠血清中内源性代谢物的变化，探讨TSCR治疗佐剂性关节炎的可能作用机制。
1 材料与方法
11 试药与仪器 弗氏完全佐剂（Freund's complete adjuvant）购自Sigma公司；甲醇（批号20130129）购自国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯；威灵仙总皂苷，经UV及UPLC 检测，纯度92%以上，购自陕西宝鸡宣威生物技术有限公司。
GC色谱仪（Agilent 7890A， Agilent，USA）；Rxi5Sil MS毛细管柱（250 μm×30 m，025 μm Restek， USA）；质谱仪（LECO Chroma TOF PEGASUS 4D，LECO，USA）；GL20A全自动冷冻高速离心机（湖南仪器仪表总厂离心机厂）；-80 ℃超低温冰箱（日本三洋公司）。
12 动物 SD级雄性大鼠24只，体重（220±20） g，由安徽医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（皖）2011002。室温18～22 ℃，相对湿度40%～60%，动物自由进食、饮水。
13 AA模型的建立和给药 实验动物按体重随机分为3组，每组8只，分别为正常组（Normal）、模型组（Model） 和威灵仙总皂苷组（TSCR），除正常组外，每只大鼠于右后足趾皮内注射Freund′s完全佐剂01 mL。正常组和模型组大鼠灌胃给予等体积的生理盐水，TSCR组灌胃威灵仙总皂苷，剂量为100 mg・kg-1・d-1，每天1次，连续16 d。
14 组织病理学检查 麻醉大鼠，取完整大鼠左后足（非致炎侧）踝关节，置于10%中性甲醛固定，经常规脱钙、脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色后，光镜下观察各组大鼠踝关节病理组织学变化。
15 血清样品采集和处理 各组大鼠均于末次给药后2 h，麻醉，腹主动脉取血，3 000 r・min-1离心10 min，取上清液冷冻保存至-80 ℃待用。分析前将血清样品于37 ℃解冻，解冻后取100 μL血清，加035 mL甲醇，涡旋混匀，12 000 r・min-1离心15 min，取上清液，于2 mL进样瓶（甲烷硅基化）中。在真空浓缩器中干燥提取物35 ℃，15 h；向干燥后的代谢物加入60 μL甲氧胺盐试剂，混匀后，放入烘箱中80 ℃孵育20 min；向每个样品中迅速加入80 μL BSTFA（含有1% TCMS），将混合物70 ℃孵育1 h；冷却至室温，向混合的样本中加入10 μL FAMEs（饱和脂肪酸甲酯标准混合液，溶于氯仿C8C16 1 g・L-1；C18C30 05 g・L-1）；混匀，上机检测。
16 色谱和质谱条件 气相色谱飞行时间质谱联用仪配有Rxi5Sil MS柱，GCTOFMS具体分析条件如下：进样量1 μL，不分流模式；载气氦气；前进样口吹扫流速3 mL・min-1；柱流速1 mL・min-1；柱温50 ℃保持1 min，以每分钟10 ℃的速率上升至330 ℃，保持5 min；前进样口温度280 ℃；传输线温度280 ℃；离子源温度250 ℃；电离电压-70 eV；扫描方式m/z 30～600；扫描速率20 spectrum・s-1；溶剂延迟366 s。
17 代谢组学数据处理 数据处理使用的是LECO公司的Chroma TOF43X 软件和LECOFiehn Rtx5数据库，主要用于原始峰识别，过滤噪音和校正基线，峰对齐，谱图去卷积解析，峰定性和定量。将共有的峰导入DEMO（Umetrics AB，Umea，Sweden）软件，经归一化处理后，对其进行主成分分析（principal component analysis，PCA），再用偏最小二乘法判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLSDA）进行外部模型验证，最后再结合VIP，筛选出潜在的生物标志物。采用SPSS 190 软件进行统计学处理，2组间比较采用t 检验，检验标志性代谢物组间差异的显著性，P
2 结果
21 组织病理形态学变化 由HE染色图可知，正常组大鼠细胞排列整齐，踝关节软骨表面光滑无破坏，无炎性细胞浸润及血管增生等症状；模型组大鼠软骨组织结构遭到破坏，滑膜细胞增生变形，细胞排列紊乱，有大量炎性细胞浸润增生及滑膜血管翳形成，提示佐剂性关节炎动物造模成功；TSCR组软骨组织、细胞形态和炎性细胞浸润均得到改善，提示威灵仙总皂苷对佐剂性关节炎具有很好的治疗作用，见图1。
22 数据分析 基于LECOFiehn Rtx5数据库，对原始数据进行预处理，再通过Chroma TOF 43X 软件对数据校正后补齐空白值，消除数据噪音，然后用内标归一，采集血清样品的代谢物谱。正常组、模型组和TSCR组大鼠血清的总离子流色谱图（TIC）见图2。
为了进一步说明TSCR治疗后AA大鼠代谢物谱的变化，对代谢谱进行预处理并运用PCA识别技术对其进行分析。PCA是将分散在一组变量的信息集中到2，3个综合指标（主要成分）上，从而利用主要成分提取数据集的特征，是对原始数据的真实再现，正常组、模型组和TSCR组大鼠血清的PCA得分图见图3。实验结果表明，由于各种因素的干扰，3组未完全分开，各组内样本差异较大。
为了获取更加理想的组间分离及增强对分类贡献大的变量的识别，进一步进行了有监督的PLSDA分析，PLSDA是先对组间区分性大的部分数据建立类别间的数学模型，然后再将剩余的部分数值去比对，得出一些评判数值如监督模型的解释率（R2Y）、模型的预测能力（Q2） 等用以考察模型的有效性，它们的大小直接反映了该模型的可靠程度。结果表明，3组完全被分开，说明造模后大鼠血清内源性代谢物水平发生了变化，给药后的TSCR组渐渐向正常水平靠近；R2Y=0945，Q2=0646，可见该模型稳定性、预测能力均较好。在此之后，通过排列实验随机多次（n=200）改变分类变量y的排列顺序得到相应不同的随机Q2对模型有效性做进一步的检验。通过排列实验获得的R2=0853，Q2=-0089 3，Q2负值表明该模型是可靠的，且未存在过拟合现象，结果见图4。
23 潜在生物标志物的鉴定 通过PLSDA分析后，结合变量重要性投影值（variable importance projection，VIP）及P
为直观反映潜在生物标志物在各组中相对浓度的变化情况，绘制了17个潜在生物标志物的箱式图，见图5。结果显示，与正常组相比，2羟基丁酸、天冬氨酸、乙醇胺、肌醇、胸腺嘧啶和反式4羟基L脯氨酸等在模型组中明显升高，柠檬酸、棕榈醇、苯乙醛和棕榈油酸等在模型组明显降低。经TSCR干预后，上述17个差异化合物都有向正常水平靠近的趋势，说明TSCR对AA大鼠代谢的调节作用。
24 代谢通路网络图
通过查阅文献和KEGG（http：//www genomejp/kegg/）网上数据库，将筛选出的潜在生物标志物构建代谢通路图，有助于更加清晰直观地了解AA在体内代谢异常的路径，见图6。由弗氏完全佐剂诱导的AA大鼠代谢紊乱主要与脂代谢、氨基酸代谢和能量代谢等代谢通路相关，将几条主要代谢发生紊乱的通路串联起来，可见类风湿性关节炎是一种涉及到多个代谢途径紊乱的疾病。经过TSCR干预后，代谢物的水平均有向正常水平回转的趋势，代谢通路的紊乱也得到改善，提示TSCR对AA模型有较好的治疗作用。
3 讨论
代谢组学是以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，定性定量研究生物体的内源性代谢产物，分析生物体在不同状态下代谢指纹图谱的差异，获得相应的生物标志物群，从而揭示生物体在特定时间、环境下的整体功能状态[67]。代谢组学的研究方法和策略已经在中药研究中发挥重要的作用，但从代谢组学角度，探讨TSCR治疗RA可能的机制研究尚未见报道。因此，本文采用基于gctofms 技术的代谢组学方法并结合多元统计分析来研究佐剂性关节炎模型大鼠在威灵仙总皂苷干预下的血清代谢物谱的变化，结合t检验来评价TSCR对大鼠血清中差异性代谢物的作用效果，进而推测TSCR的作用机制。结果表明，AA大鼠血液代谢物谱发生了变化，血清中花生四烯酸、苯丙氨酸和肌醇等含量显著上调；棕榈醇、柠檬酸和苯乙醛等含量显著下调。TSCR干预后，上述潜在生物标志物均有向正常水平回归的趋势。
棕榈油酸和棕榈醇是不饱和脂肪酸代谢的中间体，脂肪酸分解代谢后经糖酵解和有氧氧化供能，也可转变成糖脂肪酸与清蛋白结合转运入各组织经β氧化供能[8]。在RA大鼠中其水平明显下降，可能是由于关节炎软骨的生化代谢紊乱造成的。肉豆蔻酸是炎症相关的重要物质[9]，花生四烯酸为前列腺素的前体，当受刺激时，增加机体的脂肪氧化降解过程，使炎症介质代谢紊乱[1011]，模型组中肉豆蔻酸和花生四烯酸为水平升高，威灵仙总皂苷干预后，可减少在血清中的含量，从而抑制相关的炎症反应。
苯丙氨酸是具有生理活性的芳香族氨基酸，是人体必需氨基酸之一，体内代谢后生成苯乙醛。据报道，RA和SLE患者血清中苯丙氨酸的浓度降低[12]。本实验中在RA大鼠尿液苯乙醛水平降低，这表明苯丙氨酸代谢受到一定的阻断作用。天冬氨酸是天冬氨酸代谢途径的化合物，是通过草酞乙酸的转氨作用形成的，也是合成赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的共同前体。模型组中天冬氨酸水平升高，提示类风湿性关节炎患者血清游离氨基酸代谢紊乱，与研究结果一致[13]。亮氨酸是支链氨基酸，α酮异己酸是亮氨酸的代谢产物，由异戊酸分解成乙酰辅酶A和乙酰乙酸，具有调节蛋白质代谢的作用。与正常组相比，模型组中α酮异己酸含量升高，其原因是蛋白质、糖合成和分解紊乱造成的。
柠檬酸主要参与三羧酸循环，有研究发现，体内羧酸循环代谢活动的异常，可能与关节软骨及软骨细胞的生化代谢紊乱有关[14]。本实验中模型组柠檬酸水平显著下降，表明弗氏完全佐剂诱导的AA大鼠存在三羧酸循环紊乱。
蔗糖6磷酸参与糖代谢途径，受炎症刺激时，蔗糖6磷酸主要通过糖酵解和磷酸戊糖途径大量分解，且这2个途径对于线粒体氧化是炎症的一个关键特性[15]。研究表明[1617]，RA滑膜组织中糖酵解活性增加，易造成滑膜缺氧并形成酸性微环境。本研究中发现模型组中蔗糖6磷酸水平升高，RA滑膜细胞增殖和大量炎症细胞浸润，导致局部毛细血管氧弥散距离增加和耗氧量增加，致RA关节腔缺氧[18]。N乙酰甘露糖胺为已糖胺衍生物的一种，在自然界里其以D型N乙酰神经氨酸的形态作为糖蛋白的组成糖而广泛存在。AA大鼠中N乙酰D甘露糖胺水平升高，说明糖代谢紊乱，N乙酰甘露糖胺可能通过影响糖代谢而发生炎症，威灵仙总皂苷给药后，N乙酰D甘露糖胺的水平明显得到回调。
2羟基丁酸是α酮丁酸形成过程中的副产物，该反应由乳酸脱氢酶或2羟基丁酸脱氢酶催化，与谷胱甘肽合成代谢与能量代谢有关。模型组大鼠血清中2羟基丁酸水平显著下降，与研究结果一致[19]；给予威灵仙总皂苷干预后，可上调2羟基丁酸水平，提示其对AA大鼠紊乱的谷胱甘肽合成与能量代谢具有调节作用。
乙醇胺是乙醛酸代谢产物，乙醛酸循环在乙醛酸体中进行，是与脂肪转化为糖密切相关的反应过程[20]。模型组大鼠血清中乙醇胺水平升高，导致乙醛酸代谢紊乱，然而造成紊乱原因需要进一步的研究。
胸腺嘧啶是自胸腺中分离得到的一种嘧啶碱，参与嘧啶的合成代谢。可进一步分解生成β丙氨酸等，β丙氨酸经代谢生成氨基丙二酸。β丙氨酸是辅酶A的组分，辅酶A为参与体内乙酰化反应的辅酶，对糖、脂肪和蛋白质的代谢起重要作用[21]。与正常组相比，模型组大鼠血清中胸腺嘧啶和氨基丙二酸水平升高；威灵仙总皂苷干预后，可下调胸腺嘧啶和氨基丙二酸。
肌醇是精氨酸和脯氨酸代谢产物，可以直接清除氧自由基，与氧化应激有关[22]。模型组中肌醇水平升高，表明AA的发病机制可能受精氨酸和脯氨酸代谢的影响。脯氨酸是合成人体蛋白质的重要氨基酸之一，反式4羟基L脯氨酸是脯氨酸代谢的中间产物，与能量代谢有关，同时有抗氧化作用，文献报道[23]，脯氨酸代谢与RA密切相关，其代谢异常会影响柠檬酸循环，降低炎性反应状态下的软骨细胞的代谢水平，造成炎性细胞对软骨和骨质的损伤。
综上，威灵仙总皂苷对佐剂性关节炎大鼠具有治疗作用，其机制可能与调节紊乱的脂代谢、氨基酸代谢以及能量代谢等有关。
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