吉林白鹅α干扰素基因的克隆与序列分析

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摘要：从吉林白鹅（Anser cygnoides）肝脏组织提取基因组DNA，应用Primer 5.0软件设计一对加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的特异性引物，PCR扩增得到α干扰素基因（IFN-α），将PCR产物克隆至pMD18-T克隆载体，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落进行鉴定和测序。结果表明，IFN-α已被成功克隆。序列分析结果显示该基因序列与GenBank中已知的狮头鹅（A. anser）IFN-α序列（登录号HQ009755）同源性为99.5%。

关键词：吉林白鹅（Anser cygnoides）；α干扰素基因；克隆；序列分析

中图分类号：Q785；S835 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）21-4899-03

Cloning and Sequence Analysis of Interferon-α Gene in Jilin White Goose

LI Gong-mei1，LI Mao-hui2，YAN Jin-ming2，LI Yu-mei3，LIU Ke-yue4，QIAN Ai-dong1

（1.College of Animal Science and Technology， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；

2.Jilin China Tai Enterprise Co.， Ltd.， Changchun 130033， China；3. Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Jilin University， Changchun 130062，China； 4. School of Basic Medical Science， Jiujiang University， Jiujiang 332000， Jiangxi， China）

Abstract： The interferon-α gene（IFN-α）fragment was amplified with a pair of specific primers within BamHⅠ and EcoRⅠ restriction sites by PCR with the genome DNA extracted from liver of Jilin white goose（Anser cygnoides）. PCR product was cloned into vector pMD18-T and used to transform DH5α competent cell. Sequential analysis showed that the IFN-α was successfully cloned. Its homogeneity with reported A. anser IFN-α gene in GenBank（Accession No. HQ009755） was 99.5%.

Key words： Jilin white goose（Anser cygnoides）； IFN-α gene； cloning； sequence analysis

干扰素（Interferon，IFN）是一种干扰病毒繁殖的免疫活性细胞因子[1]，其中α干扰素（IFN-α）可抑制感染细胞中病毒mRNA的翻译，并促使病毒mRNA降解，能提高细胞表面MHCⅠ类分子的表达水平，有助于向T细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解，并可增强NK细胞对病毒的杀伤能力[2]。目前人[3]、狗[4]、猪[5]、鸡[6，7]、鸭[8]等的IFN序列均已被克隆，并进行了相应的研究及临床应用，关于鹅（Anser cygnoides）IFN的报道较少，本研究参照狮头鹅（A. anser）[9]等IFN的报道，利用动物基因组试剂盒提取鹅肝脏中的总DNA，采用PCR技术克隆获得吉林白鹅IFN-α基因，并对其进行序列测定分析，以期为进一步研究鹅IFN的分子生物学特性、抗病毒作用机理及研制防治鹅病毒性疾病的新型制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物为教育部动物生产及产品质量安全重点实验室饲养的2月龄吉林白鹅。

E. coli DH5α由吉林农业大学生命科学实验室提供；pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶、SacⅠ、 XhoⅠ、琼脂糖、dNTPs、X-Gal、T4 DNA Ligase购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA Marker购自天根生化科技（北京）有限公司；氨苄青霉素、DNA凝胶回收纯化试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司；酵母浸出粉、胰蛋白胨为Oxoid公司产品。

1.2 方法

1.2.1 吉林白鹅基因组DNA提取 吉林白鹅颈静脉放血致死，无菌取1～20 mg肝脏，采用DNA提取试剂盒提取吉林白鹅肝脏中的基因组。

1.2.2 IFN-α序列的PCR扩增 根据GenBank中狮头鹅的IFN-α序列（GenBank登录号：HQ 009755）设计引物，上、下游引物序列分别为P1：5′-ATAGGATCCAACATGCCTGGGCCATCAG-3′；P2：5′-TCCGAATTCTTAGCGCATGGTGCGG-3′（划线部分分别为BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点），目标片段大小为576 bp，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。以鹅肝脏总DNA为模板对IFN-α基因进行PCR扩增。50 μL PCR反应体系包括ddH2O 37.5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、20 μmol/L P1、P2各1 μL、DNA模板 4 μL、5 U/μL Ex Taq 0.5 μL。PCR反应程序为95 ℃ 8 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 mim，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。

1.2.3 IFN-α基因的克隆与序列分析 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，与pMD18-T载体连接，得到pMD18-T-IFN-α，质粒转化DH5α感受态细胞，涂布平板，挑取单菌落接种到LB（Amp+）液体培养基中，37 ℃摇床培养过夜，抽提质粒并进行酶切鉴定。将阳性重组质粒送生工生物工程（上海）有限公司进行序列测定。测序结果与GenBank中狮头鹅的IFN-α基因进行核苷酸序列比对。

2 结果与分析

2.1 IFN-α基因的PCR扩增结果

以从吉林白鹅肝脏组织提取的基因组DNA为模板扩增IFN-α基因，产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后得到一条特异性条带，条带清晰明亮，大小约为600 bp，与预期相符（图1）。

2.2 IFN-α基因的克隆与鉴定

将回收纯化的PCR产物克隆到pMD18-T载体上，得到pMD18-T-IFN-α，质粒转化DH5α感受态细胞，挑取阳性菌落，用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，同时进行质粒的PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示产物与预期片段大小一致（图2），说明IFN-α基因已被成功克隆。

2.3 IFN-α基因测序结果

测序结果显示本实验扩增出了全长为576 bp的基因片段，编码191个氨基酸，氨基酸的N端为由30个疏水氨基酸组成的信号肽，其余为由161个氨基酸组成的成熟多肽，其中成熟多肽中有2个糖基化结合位点和7个半胱氨酸残基。经DNAStar软件分析发现所测序列与GenBank中的狮头鹅HQ 009755核苷酸序列相似性高达99.5%（图3），仅在397位有1个碱基发生突变，即由C变为G，说明吉林白鹅IFN-α基因序列存在单核苷酸多态性。推导的IFN-α氨基酸序列见图4，其与GenBank中狮头鹅IFN-α氨基酸序列同源性为99%。进一步将吉林白鹅IFN-α与GenBank中鸭、鸡及人的IFN-α基因序列和氨基酸序列进行比对，发现吉林白鹅IFN-α与鸭、鸡及人相应核苷酸序列的同源性分别为97.2%、44.3%及25.5%，而氨基酸序列的同源性分别为94.5%、17.3%及5.8%。

3 讨论

干扰素有种属特异性，亲缘关系越近其同源性越高，本实验吉林白鹅IFN-α基因与GenBank中已知狮头鹅的IFN-α基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为99.5%和99%，而与鸡及人的IFN-α基因核苷酸序列和氨基酸序列的同源性均低于50%。虽然克隆得到的鹅IFN-α基因与鸡及哺乳动物相关基因的同源性较低，但其半胱氨酸具有保守性，且同样存在着2个糖基化位点，表明它也是一种糖蛋白。

干扰素作为一种抑制和干扰病毒繁殖的可溶性细胞因子，在免疫调节、抗肿瘤及抗病毒等方面发挥着重要的作用[10]，可刺激机体淋巴细胞分泌产生多种广谱抗病毒蛋白质，阻断病毒的繁殖。当干扰素系统被激活后，细胞接触干扰素只需几分钟就产生抗病毒状态，动物在1～3周内对其他病毒的重复感染也有抵抗作用[11]。虽然病毒性疾病能诱导机体产生少量干扰素，在体内抑制病毒的增殖，但因表达量低难以保护机体抵抗疾病的侵袭，因此研究人员希望能通过基因工程方法规模化获得鹅重组干扰素并将其应用到临床。本实验为进一步研究鹅IFN-α在抗病毒、抗肿瘤等方面的作用及鹅IFN生物制剂的研发奠定了基础。

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收稿日期：2011-11-16

作者简介：李公美（1975-），女，山东费县人，讲师，在读博士研究生，主要从事动物病毒学研究，（电话）13894890311（电子信箱）

；通讯作者，钱爱东，教授，博士生导师，（电话）0431-84533426（电子信箱）。