反义TIMP-1表达质粒对实验性肝纤维化的影响

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[摘要]目的：观察反义timp-1真核表达质粒对实验性肝纤维化的影响。方法：运用重组DNA技术及反义技术，构建反义TIMP-1真核细胞表达质粒，经脂质体包埋，将其导入实验性肝纤维化大鼠模型体内，通过半定量RT-PCR，病理形态学观察及western bloting免疫印记技术，观察反义TIMP-1表达质粒对大鼠肝纤维化的影响。结果：反义TIMP-1质粒组与肝纤维化组、空质粒组相比TIMP-1mRNA、MMP-13mRNA及蛋白表达明显减少（P0.05）；正常对照组与各实验组之间的病理学分级有显著性差异（P

[关键词]肝纤维化；反义基质金属蛋白酶抑制因子-1；基质金属蛋白酶-13

肝纤维化主要是由于细胞外基质（ECM）降解减少导致ECM沉积增多而形成，细胞外基质的降解受基质金属蛋白酶-基质金属蛋白酶抑制剂（MMPs-TIMPs）系统的调节。基质金属蛋白酶（MMPs）在降解纤维化肝脏过多细胞外基质（ECM）的过程中起主要作用，其中间质胶原酶

（人MMP-1，鼠MMP-13）在降解纤维化肝脏ECM过程中起重要作用[1]。本研究构建了反义pcDNA3.1（+）/TIMP-1真核表达载体，将其导入到复合因素复制的实验性肝纤维化大鼠体内，观察pcDNA3.1（+）/TIMP-1真核表达质粒对实验性肝纤维化的影响。

1材料与方法

1.1、材料

正常纯种系SD大鼠60只，雌性，体重200～300g。脂质体Lipofectmine2000、Trizol Reagent、UNIQ-200大剂量质粒抽提试剂盒、UNQI-10柱式PCR切胶回收试剂盒。一步法RT-PCR试剂盒、T4DNA连接酶、限制性内切酶Xholl、EcoRI等。

1.2、反义质粒的构建和鉴定

根据TIMP-1cDNA序列设计PCR扩增引物，取正常大鼠肝组织，用TRIzol法提取总RNA，检测RNA完整性、浓度和纯度，OD260/OD280在1.8～2.0之间。用一步法RT-PCR试剂盒获得目的基因TIMP-1cDN段，采用巢式PCR扩增TIMP-1基因片断。并纯化回收PCR产物，使用限制性核酸内切酶EcoRI、XholI双酶切pcDNA3.1（+），线性化pcDNA3.1（+）纯化回收后和TIMP-1基因片段定向及反向连接，构建以pcDNA31（+）为载体的反义TIMP-1基因真核表达质粒。诱导感受态细胞，转化JM109大肠杆菌。酶切证实的阳性克隆送上海生物工程公司测序分析。

1.3、大鼠肝纤维化模型制备及质粒导入

雌性SD大鼠60只，体重200~300g，随机分为4组：反义TIMP-1治疗组（14只）、pcDNA3.1（+）空质粒组（17只）、肝纤维化组（17只）、正常对照组（12只）。采用CCl4复合法制备大鼠肝纤维化模型，造模结束后，治疗组按反义TIMP-1/pcDNA3.1（+）重组质粒100µg，空质粒组给予pcDNA3.1（+）质粒100µg经腹腔导入大鼠肝纤维化模型体内，同时正常对照组腹腔注射等量的0.9%的生理盐水。每9天1次至第8周，共注射5次，8周末时。

1.4、结果观察

实验动物第8周结束后，乙醚吸入麻醉，取部分肝组织迅速放入液氮中速冻后，-70℃保存备用，部分肝组织置于10%甲醛溶液中固定，作病理学检查。

1.5、病理形态学观察

对肝组织切片进行HE、VG染色，对各实验组肝组织的病理学形态进行观察，根据王宝恩等[2]肝纤维化分级标准对各实验动物的肝组织切片进行病理学分级。

1.6、运用RT-PCR半定量检测肝组织内TIMP-1mRNA，MMP-13mRNA的表达。

1.7、westernbloting印记技术检测大鼠肝组织中MMP-13及TIMP-1蛋白表达

1.8、统计学方法

计量资料采用样本均数±标注差，采用SPSS软件做方差分析（多个样本均数的两两比较），等级资料病理形态学分级结果作Ridit分析，P

2结果

2.1、肝组织的病理学分级

表2各组肝纤维化的病理分级

组别 肝纤维化分级 合计

0 Ⅰ－Ⅱ Ⅲ－Ⅳ Ⅴ－Ⅵ

正常对照组 12 0 0 0 12

反义TIMP-1质粒组 0 3 4 4 11a

空质粒组 0 0 0 10 10ab

肝纤维化组 0 1 0 10 11abc

注：a与正常对照组比较P

2.2、各组大鼠肝组织中TIMP-1mRNA及蛋白的表达

各组大鼠肝组织中TIMP-1mRNA及蛋白的相对表达量TIMP-1/β-actin、TIMP-1蛋白表达量（TIMP-1/β-actin灰度值）如下图（表3）示

表3各组大鼠肝组织中TIMP-1mRNA及蛋白的表达（±S）

组别 n TIMP-1/β-actin TIMP-1蛋白

正常对照组 12 0.61±0.11 24.6±2.7

反义TIMP-1质粒组 11 0.91±0.11a 58.96±3.79a

空质粒组 10 0.98±0.12ab 287.2±20.8ab

肝纤维化组 11 1.04±0.12abc 298.6±33.4abc

注：a与正常对照组比较P

2.3、各组大鼠肝组织中MMP-13mRNA及蛋白的表达

各组大鼠肝组织中MMP-13mRNA及蛋白的相对表达量MMP-13/β-actin，MMP-13蛋白（MMP-13/β-actin灰阶值）如下图（表4）示。

统计学分析：应用SPSS11.0统计软件对数据进行单因素方差分析（多个样本均数的两两比较））。

表4各组大鼠肝组织中MMP-13mRNA及蛋白的表达（±S）

组别 n MMP-13/β-actin MMP-13蛋白

正常对照组 12 0.24±0.39 18.24±2.21

反义TIMP-1质粒组 11 0.26±0.28a 19.38±3.43a

空质粒组 10 0.11±0.26ab 121.27±1.88ab

肝纤维化组 11 0.12±0.32abc 116.32±2.71abc

注：a与对照组比较P>0.05；b与反义TIMP-1质粒组比较P0.05；a与肝纤维化组比较P

3讨论

本研究成功构建反义TIMP-1/PCDNA3.1（+）真核细胞表达质粒，并将其以脂质体包埋，通过腹腔注射的方式导入实验性肝纤维化大鼠体内，根据实验结果我们认为反义TIMP-1/PCDNA3.1（+）真核细胞表达质粒能在体内有效表达，并能够抑制肝脏中TIMP-1mRNA及蛋白的表达。MMP-13mRNA及蛋白的表达在肝纤维化的逆转过程中有所下降，可能是TIMP-1表达明显减少，MMP-13表达为与TIMP-1的表达维持相对平衡，MMP-13的量相对减少但其活性相对增加，显著提高了活化性及潜在性间质胶原酶活性，促进了间质胶原酶的活化，ECM降解增加，合成减少，从而减轻纤维化程度。

国内杨长青等[3]运用重组DNA技术，构建大鼠MMP-1、反义TIMP-1真核细胞表达质粒，导入免疫性大鼠肝纤维化模型体内，研究发现MMP-1、反义TIMP-1表达质粒对肝纤维化有一定的逆转作用，MMP-1表达质粒的作用较弱，而通过给予反义TIMP-1封闭纤维化肝TIMP-1的表达，则可使体内固有的MMP-1的活性得到释放，从而导致胶原的降解。ＷatanabeT等[4]用CCl4诱导大鼠肝纤维化，RT-PCR结果显示，MMP-13ｍRNA在正常对照组表达微弱，用CCl4处理当肝细胞脂肪变性明显而尚未达到纤维化时表达显著升高，而形成明显的纤维化时表达便显著下降。赵志海等[5]研究发现在肝纤维化逆转过程中，MMP-13mRNA及其蛋白的表达量先维持一定水平，然后逐渐减弱，并与纤维化程度有一定相关，提示MMP-13的表达与纤维化逆转有关。KnittelT等[6]的研究也发现在四氯化碳所致的大鼠肝纤维化模型中肝纤维化明显时，MMP-13mRNA仅能被检测到弱表达，但在肝纤维化恢复期基因表达又显著增加。赵志海等[7]研究发现在肝纤维化逆转过程中，MMP-13mRNA及其蛋白的表达量先维持一定水平，然后逐渐减弱，并与纤维化程度有一定相关，提示MMP-13的表达与纤维化逆转有关。本实验结果与之有不同，可能与致肝纤维化恢复的外因不同及测定MMP-13表达的时期不同有关。

根据本研究结果，认为反义TIMP-1/PCDNA3.1（+）真核细胞表达质粒也能够在RNA水平封闭肝脏中内源性TIMP-1的表达，使其表达的量减少，释放间质胶原酶的活性，从而延缓肝纤维化进程。在肝纤维化逆转过程中，TIMP-1都起着重要作用，各种原因所致TIMP-1的减少，使MMP-13的活性恢复，对ECM的降解能力增强，ECM降解增多，沉积相对减少，肝纤维化得以在一定程度上逆转，本实验为将来肝纤维化的基因治疗奠定基础。

参考文献：

[1] Matrisian LM. The matrix-degrading metalloproteinases.Bioessays,1992, 14: 455-463.

[2]王宝恩，王惠吉，朱家璇，等.中药复方丹参不同剂型治疗肝纤维化实验研究与临床观察[J].中华肝脏病杂志，1993，（1）：69-72.

[3]杨长青，胡国龄，谭德明，等.基质金属蛋白酶-1、反义金属蛋白酶组织抑制因子-1表达质粒对大鼠肝纤维化的影响[J].中华传染病杂志，2000，18（1）：29-32.

[4] Watanabe T,Niioka M,Hozawa S,et al .Geng expression of interstitial collagenase I both progressive and recovery phase of rat liver fibrosis induced by carbonterachloride.J hepatol, 2000,33(2):224-35

[5]赵志海，辛绍杰，赵景民，等.实验性肝纤维化形成和逆转过程中基质金属蛋白酶13蛋白及其mRNA表达[J].军医进修学院学报，2002，23（3）：214-216.

[6] KNITTEL T,MEHDE M,KOBLOD D,et al.Expression patterns of matrix metelloproteinases and their inhibitors in parenchymal and nonparenchymal cells of rat livers:regulation by TNF alfa and TGF beta[J].J Hepatol,1999,30(1):48-60.

[7]徐正府姚登福邱历伟吴玮吴信华陆翠华慢性肝炎、肝硬变及原发性肝癌患者血清ＭＭＰ13及ＴＮＦα的表达江苏医药2006，32：25-26.