番木瓜遗传改良研究进展
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摘要 综述番木瓜在离体培养、杂交育种、基因工程育种方面的研究进展，分析其今后发展存在的问题，并对其发展前景进行展望。
番木瓜属番木瓜科多年生常绿小乔木，是热带、亚热带地区广泛栽培的热带名果之一，在我国约有70多年的栽培历史。目前，番木瓜的种植模式、病害控制和种苗生产等问题仍是番木瓜种植和推广的主要障碍。近50年来，离体培养、杂交育种、人工诱变育种、基因工程等现代遗传育种学及生物技术的发展，为解决这些难题提供了新的途径。笔者就生物技术及各育种手段在番木瓜研究中的应用进行综述。
1番木瓜的离体培养
离体培养就是利用体细胞进行无性繁殖的一种方法。在离体培养中外植体的选择相当广泛，根、叶柄、茎段、子叶、胚珠、幼胚等都被相继用来进行不同目的的离体培养研究。目前，国外已经有许多关于番木瓜离体繁殖体系、体细胞胚胎和器官发生、芽体繁殖、细胞原生质体培养等方面的报道。例如早在1978年，Litz[1]等用花药悬浮液体培养诱导番木瓜单倍体获得了0.1%的再生频率，证实利用花药或花粉培养番木瓜单倍体是可行的。Fredah[2]等通过花药培养诱导番木瓜胚的形成，结果发现花药培养得到的番木瓜植株绝大部分是雌性株，可用以繁殖雌性的番木瓜。1974年，DeBruijne[3]等首次报道了以番木瓜的叶柄诱导形成愈伤组织，并产生了体细胞胚，但未报道体细胞胚是否培养出小植株。Litz等人在1977年[4]，用番木瓜的茎尖和叶柄在MS和White培养基上获得了试管株系；1982年[5]，他们又从胚珠产生的愈伤组织诱导产生体细胞胚并获得再生植株；1983年[6]，他们通过培养番木瓜胚珠获得了大量体胚并长成苗。1987年[7-8]，Drew和Chen等也分别从根外植体诱导产生体细胞胚和再生植株。此外，Fitch等[9-10]分别以幼胚、下胚轴为外植体诱导产生了体细胞胚，并实现了植株再生。
近年来，随着组织培养技术的迅速发展及其与分子生物学各学科领域交叉结合的发展，国内也有不少学者对番木瓜的离体培养进行了研究。如叶克难等[11]以根、茎为外植体进行悬浮培养后，获得了大量体细胞胚产生的再生植株；朱西儒等[12]以叶为外植体诱导产生了胚性愈伤组织并获得再生植株；曾继吾等[13]以子叶和幼胚2种不同的外植体诱导产生愈伤组织，结果2种来源的愈伤组织均能诱导成胚性愈伤组织并形成完整的植株，而且体细胞胚的发生率决定于外植体和培养基的激素成分。此外，邹韵霞等[14]报道，在番木瓜受精胚珠诱导体细胞胚发生的过程中，NAA+BA+GA3组合诱导效果最佳，能获得理想的胚性愈伤组织和体细胞胚。林治良等[15]和周鹏等[16-17]以番木瓜侧芽作为外植体，分别在MS和BM培养基上建立了试管离体繁殖体系。蔡英卿等[18]报道了外植体、糖类、激素、有机物、光照等因素对番木瓜体胚诱导的影响。
2番木瓜的杂交育种
杂交育种是在各种粮食作物、经济作物、水果蔬菜等作物上应用广泛且取得了良好成效的常规育种手段之一。在番木瓜的杂交育种中，国内外已选育出许多优良的栽培品种[19]，如广州市果树研究所先后选育出穗中红、美中红、优8等优良品种[20]。但一直以来，番木瓜病毒病是限制番木瓜大面积种植和发展利用的最大因素之一，在已报道的近10种番木瓜病毒病中，番木瓜环斑病（PRV）危害最严重。除了报道的少数抗PRV的杂交种和仅有的3种抗PRV的野生种（茎花番木瓜、托叶番木瓜和有毛山番木瓜）外，几乎所有的番木瓜栽培品种都不能抵抗PRV的危害[21]。但由于这3种野生种不仅不能食用，而且与C.papaya存在不同程度的杂交不亲和性，这无疑给番木瓜的杂交育种工作带来了困难，难以很好地利用天然抗PRV的基因。
近年来，番木瓜实验胚胎学、酶学等研究的不断发展，已有一些学者成功地获得了一些有利的杂交品种。如夏威夷大学的Manshardt和Wenslaff[22]在杂交试验中，以3个C.papaya株系（Kapaho、Hawaii和Washington）和2个C.caulofora株系（UH345和UH372）为亲本，全部组合的种间互交后，结果只有UH345为母本的组合能够产生发育成熟的合子胚。Moore等[23]通过同工酶和PAGE检测得到源于C.papaya×C.caulofora杂种胚性愈伤组织的体细胞植株，经过分析其相应的染色图谱，确定该体细胞胚再生植株是种间杂种的后代。后来，Chen等[24]在实验中也证实了C.papaya×C.caulofora杂种胚的再生植株具有种间杂种的真实性。朱西儒等[25]在番木瓜杂交育种实验中获得了2个较好的杂交组合，杂交后代的抗病性有所提高。黄建昌等[21]也通过轮回选择方式，用多个组合进行种内杂交，获得抗病性较强的杂交后代。
3番木瓜的基因工程育种
长期以来，番木瓜都面临着病毒病的危害，尤其是PRV，但由于传统防治方法有着诸多的缺陷，防治效果并不理想。利用基因工程进行抗病品种的培育是防治和治理病毒病的根本途径。目前番木瓜基因工程育种主要采取2种策略：一是直接分离克隆抗PRV基因，将之转入番木瓜基因组中，使之获得抗性；二是将PRV病毒外壳蛋白或核酸酶基因转入番木瓜中，使之获得抗性[26]。1990年，Fitch等[9]建立了以番木瓜胚性愈伤组织为受体的共培养转化体系，并通过体细胞胚发生获得了2株表达HA5-1的转基因植株，进一步的繁殖扩增成为2个品系。1992年，Fitch等[27]用基因枪法把构建在PG482GG的HA5-1CP的嵌合基因导入番木瓜，获得5个转基因品系，其中1个品系为高抗PRV株系，在田间种植2a都不发病。我国学者[28-29]通过酶联吸附免疫、点杂交等分子遗传学手段，也先后得到转番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因（PRAC-CP）植株及转环斑病毒外壳蛋白基因和核酸酶基因（PRSV-CP-SN）植株。叶长明等[30-31]首次将PRV复制酶（RP）突变体基因导入番木瓜获得转基因抗病品系；随后，叶长明等[32]通过对RP基因分析，证实了转PRV RP基因番木瓜对PRV抗性达到高抗或免疫，RP基因可稳定遗传并在RNA水平上表达。Tennant等[33]发现转基因番木瓜Rainbow和Sunup都抗夏威夷品种PRSV的分离物。Chiang等[34]构建了一系列重组PRSV来接种转PRSV-CP基因的Rainbow，结果表明，要获得抗PRSV不同株系的广谱抗性的转基因番木瓜，在构建时应包括CP基因的完整编码区及3′非编码区。此外，还有众多学者也开展了番木瓜转基因的研究[35-38]。
除了对番木瓜病毒病的转基因研究外，还有一些学者利用分子生物学的方法对番木瓜进行了性别的鉴定以及遗传变异的研究。Sonsri等[39]用DNA扩增指纹（DAF）技术对番木瓜性别基因标记进行了研究，虽然找到了多个性别相关的标记，但未进行遗传连锁分析。Sordur等[40]也曾用RAPD技术构建了1个番木瓜遗传连锁图谱，其中在性别决定座位两边各有1个标记，但遗传距离为7cm。周国辉等[41]应用BSA法确立了2个与番木瓜两性基因紧密连锁的RAPD标记，它们与两性基因的遗传距离分别为4.5cm和1.9cm，为番木瓜性别基因的精细定位和克隆打下了良好的基础。陈中海等[42]在实验中，应用同工酶（POD、EST、PPO）、蛋白质的SDS-PAGE以及RAPD标记三方面研究番木瓜雌株、雄株和两性株之间的差异，结果表明以上标记均可较准确地鉴别出番木瓜的雌、雄株，可作为对番木瓜进行性别鉴定的参考。Kim等[43]通过AFLP标记揭示了C.papaya的遗传多样性，该结果表明异花授粉的雌雄同体植株具有类似异花授粉雌雄异体植株的变异性；C.papaya与其余6个栽培品种也具有少量的遗传相似性，其平均值为0.432；而6个栽培品种间的遗传相似性的平均值则可达0.729，由此可推测，C.papaya可能是由其余6个品种早期的基因进化而来的。
4问题与展望
尽管番木瓜遗传改良的各方面都取得了一些进展，但在实际生产上仍有许多问题，如抗病、抗寒、优质及其稳定性等未得到根本的解决。因此，利用目前组织培养技术及分子生物学等学科领域的发展技术，不仅可以从分子水平上认识这些问题，而且还可以通过各种手段来生产经遗传改良的番木瓜品种。如选育能广泛栽培的抗寒品种，通过可能的育种手段改善果实风味；运用基因工程技术引入外源基因，将可以有目的地提高其抗性以及调控果实代谢的相关过程，解决番木瓜果实后熟迅速、易损伤腐烂、不耐贮藏的缺陷。也曾有学者报道，雌雄异株、株性高度杂合、对病毒敏感是制约番木瓜遗传改良的三大客观因素。这些不利因素给番木瓜的大面积种植和杂交育种的后代选择及性状稳定带来了困难，因此采用组织培养技术繁殖具有优良性状及抗病基因型的品种是克服番木瓜实生苗后代变异、植株感病以及生产大量优质种苗的好方法。在印度和我国台湾，这种方法已得到系统研究和生产验证。
目前国内外许多育种学家正努力通过分子标记技术来对番木瓜的基因进行探查，对番木瓜的遗传基础及遗传规律的认识正在逐步加深。实验胚胎学、细胞遗传学、形态解剖学及组织培养技术的不断发展，使得远缘杂交育种获得杂种后代，从远缘品种中导入抗病基因成为可能；同时，通过人工诱变技术获得抗性突变体也是一条较理想的育种途径。此外，基因工程技术的应用也可以进一步导入抗病基因及其他有用的基因。可以预见，随着现代生物技术和信息技术手段的发展及广泛应用，番木瓜的遗传改良将会取得更大的突破，从而对促进番木瓜的长足发展具有重要意义。
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