雷公藤不定根培养体系的建立及中试放大研究

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[摘要]以MS为基本培养基，进行雷公藤不定根的诱导研究时发现，不论是以雷公藤幼叶还是以幼叶诱导的愈伤组织为外植体，在添加1.0 mg・L^-1 IBA的培养基上均可以诱导出不定根并建立良好的不定根培养体系;以雷公藤愈伤组织建立的悬浮细胞在添加2.0～4.0 mg・L^-1 NAA时，也可以形成不定根并建立稳定的不定根培养体系，雷公藤不定根的3个培养体系中雷公藤甲素含量均超过自然生长的根皮中的含量，其中AR3不定根中雷公藤甲素含量最高，为根皮的5.3倍。在使用5 L发酵罐进行中试放大培养时，与250 mL摇瓶培养相比，每升培养基不定根增长量、次生代谢产物含量差异不大，这为通过组织培养生产雷公藤次生代谢产物奠定了基础。

[关键词]雷公藤;不定根诱导;中试放大;次生代谢产物

[收稿日期]2014-08-02

[基金项目]国家高技术研究发展计划（863）项目子课题（2011AA10A202）;中央高校基本科研业务费专项（QN2011110）

[通信作者]*李琰，副教授，硕士生导师，主要从事经济植物细胞培养及次生代谢研究，E-mail：

Establishment of adventitious root culture system and scale-up

fermentation of Tripterygium wilfordii

LI Yan1，2*， CUI Lei1，2， YANG Yu-qi1，2， ZHAO Lei1，2， LEI Jia-min1，2， ZHANG Xing2

（1. College of Life Science， Northwest A&F University， Yangling 712100， China;

2. Research and Development Center of Biorational Pesticide Northwest A&F University， Shaanxi Province

Technology and Engineering Center of Biopesticide， Yangling 712100， China）

[Abstract]Using MS as basic medium， supplemented with 1.0 mg・L^-1 IBA， the adventitious roots of Tripterygium wilfordii were induced， and the good adventitious root culture system was established by leaves or callus induced by leaves as explants. The adventitious roots were also induced with 2.0-4.0 mg・L^-1 NAA and the good adventitious root culture system established by using suspension cells from callus as materials to induce adventitious root. The content of triptolide of three adventitious roots culture system were exceeded in the natural root bark. The content of triptolide of AR3 adventitious roots was the highest about 5.3 times as that in the natural root bark. By using 5 L stirred fermentor during pilot enlarge cultivation， compared with 250 mL flask cultivation， the adventitious roots increment and secondary metabolites content per liter medium showed no significant difference. The accomplishment of this analysis laid a foundation by tissue culture production of the secondary metabolites of T. wilfordii.

[Key words]Tripterygium wilfordii; adventitious roots（AR）; scale-up; secondary metabolites

doi：10.4268/cjcmm20150110

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f. 是卫矛科雷公藤属多年生木质藤本植物，是以根皮入药的传统药用植物^[1]，主要用于祛风除湿，活血通络，消肿止痛，风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗^[2-4]，并发现有明显的抗肿瘤作用^[5-7]。雷公藤全株有毒，也是一种传统的杀虫植物，因为其对蔬菜上的多种害虫有效，被称为“菜虫药”，罗都强、周琳等通过对雷公藤的杀虫活性研究后认为，雷公藤是一种具有很好开发前景的生物农药^[8-9]。研究发现雷公藤的主要活性成分雷公藤甲素（雷公藤内酯醇）、雷公藤生物碱等是从雷公藤根皮中分离提取得到的一类次生代谢产物^[10-13]，其中，雷公藤甲素是雷公藤中活性最高的环氧二萜内酯化合物^[14]。雷公藤主要分布在长江流域以南各省区，主产于福建泰宁等地，由于雷公藤药材目前主要采自野生，开发利用不到20年，其资源就已经大幅度减少，以前盛产雷公藤的浙江、福建、江西、湖北等，野生资源都面临枯竭^[15]。伴随着雷公藤资源的减少，关于雷公藤的良种选育、扦插繁殖和种子育苗等工作也时有报道^[16-18]，但雷公藤属于木本植物，生长缓慢，一般人工种植7年，根直径在2～3 cm，才能采挖^[18]。因此，利用植物组织培养技术来获得雷公藤有效成分，不仅可以保护野生资源，还能更好地持继发展雷公藤产业，不失为一种值得探索的途径。近年来随着对雷公藤及其活性成分的需求量越来越大，雷公藤野生资源已经无法满足市场的需要，为了保障雷公藤产业可持续发展，寻找能大规模产生雷公藤活性代谢产物的途径就成为了当务之急。近几年，课题组进行了通过组织培养生产雷公藤次生代谢产物的探索，研究发现，通过雷公藤悬浮细胞诱导的不定根中雷公藤甲素含量超过了自然生长的根皮中的含量^[19-20]，这在通过组织培养生产次生代谢产物研究中比较少见^[21]。为了形成稳定的不定根培养体系，进行了雷公藤不定根的诱导及中试放大研究，为下一步进行工业化生产提供理论依据。

3.1.2雷公藤愈伤组织进行不定根的诱导及稳定性培养雷公藤根、茎、叶进行愈伤组织诱导时发现，1.0 mg・L^-1 2，4-D+0.5 mg・L^-1 KT诱导的叶愈伤组织，培养至40 d以后愈伤组织上开始有不定根形成（图1C），培养至60 d，不定根长度约为1～2 cm，根部弯曲，将形成的不定根连愈伤组织转入相同的液体培养基中继续培养时，不定根生长缓慢，呈卷曲状。将培养至第30天的叶愈伤组织转入含有不同植物生长调节剂的固体培养基中继代培养时发现（表2），培养的前40 d，愈伤组织逐渐开始生长，体积均有不同程度的增大，从第40天开始，添加不同浓度IBA，NAA培养基上的愈伤组织上面开始有不定根形成，其中，添加1.0 mg・L^-1 IBA培养基上长出的不定根长较长，呈乳白色，生长健壮（图1D）。添加不同浓度2，4-D，IAA处理的愈伤组织只是体积的增加，培养至60 d也无不定根发生。在含1.0 mg・L^-1 2，4-D+0.5 mg・L^-1 KT原培养基上继代培养的愈伤组织增长速度最快，从第40天开始，有不定根发生，但不定根细短，分枝较少（图1E）。将生长较好的不定根连同愈伤组织一起转入含有1.0 mg・L^-1 IBA的液体培养基中继续培养，1.0 mg・L^-1 IBA诱导出的不定根上逐渐形成侧根数量较多，不定根生长迅速，经过3～4次继代培养就可形成稳定的不定根培养体系（图1F，AR2）。未添加植物生长调节剂的培养基上愈伤组织逐渐枯死。

3.1.3不同植物生长调节剂对雷公藤悬浮细胞进行不定根的诱导及稳定性培养将含1.0 mg・L^-1 2，4-D+0.5 mg・L^-1KT的固体培养基上培养稳定的愈伤组织转入相同植物生长调节剂的液体培养基中继代培养3次，加入不同浓度的IBA和 NAA后发现细胞生长至对数期后部分细胞开始生根（表3），其中加入2.0～4.0 mg・L^-1 NAA的培养基生根最为明显（图1G）。继代时在超净工作台上，挑选不定根长度为1～2 cm、细胞团直径在2 mm以下、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，进行继代培养，在相同培养基上连续培养3代以上，即可形成稳定的不定根培养体系（图1H，AR3）。

3.2不同雷公藤培养体系中次生代谢产物含量的测定

对固体培养基上培养稳定的愈伤组织，转入相同的液体培养基中继代培养3次后，形成的悬浮细胞，以及不同方式诱导形成的不定根进行了次生代谢产物含量的检测（表4）。发现培养1个周期后次生代谢产物含量差异较大，其中，雷公藤不定根的3个培养体系中，雷公藤甲素、雷公藤吉碱和次碱的含量均高于悬浮细胞，其中AR3不定根中雷公藤甲素含量最高，为根皮的5.3倍，雷公藤吉碱和次碱的含量分别为根皮的88.24%，33.63%。所有培养物中雷公藤吉碱和雷公藤次碱的含量均低于自然生长的根皮中的含量，愈伤组织中雷公藤甲素和雷公藤吉碱含量均最低，分别为根皮中的8.22%，6.13%，悬浮细胞中雷公藤次碱的含量最低，只有根皮中的15.27%。

3.3雷公藤不定根中试放大培养

5 L发酵罐放大培养与250 mL三角瓶培养相比，每升培养基不定根增长量下降了6.14%，雷公藤甲素和雷公藤吉碱含量分别下降了4.90%，1.37%，雷公藤次碱含量反而上升了8.63%（表5）。可见，使用发酵罐进行大规模培养雷公藤不定根方法可行，这为通过工厂化培养雷公藤不定根生产其次生代谢产物奠定了基础。培养体系每升培养基不定根增长量DW/g・L^-1雷公藤甲素/μg・g^-1雷公藤吉碱/μg・g^-1雷公藤次碱/μg・g^-1

4讨论

植物次生代谢产物在未分化的细胞中含量一般较低，虽然许多学者进行了高产细胞系的筛选、培养基、培养条件优化等方面的研究，但往往由于细胞系不稳定，导致细胞在培养过程中次生代谢产物含量下降，甚至丧失等因素，使这一产业很难实现工业化生产^[23-24]。一般来讲，植物的次生代谢产物在已分化的器官中比愈伤组织、悬浮细胞中含量高。因此，在组织培养生产次生代谢产物研究中，人们将重点逐渐转移到了已分化的不定根等器官的培养上^[24]。通过代谢调控使外植体在培养过程中分化出不定根，这种不定根有正常根的结构和代谢特征，具有合成次生代谢产物能力强、基因型稳定，代谢产物稳定等优点^[25-26]，它已成为很多活性成分来自根部植物的首选培养方法^[27-28]。药用植物大规模不定根培养技术的工业化，已经在韩国高丽参上取得了成功，培养的规模已经达到了1万L^[29-30]。紫松果菊Echinacea purpurea的不定根培养也已经进入了规模化生产阶段^[31-32]，丹参不定根的培养已到了中试阶段^[33]。这些研究说明药用植物不定根培养是根部次生代谢产物含量较高植物工业化生产的有效途径。

形态学研究证明，包含在植物特殊分生组织结构中的根原基有很强的再生能力^[34]。董宁光等报道生长素对根原基的发生起着诱导和启动作用，核桃内源生长素水平与不定根发生能力呈正相关^[35]。周燕等对胡杨不定根发生时IAA含量的研究发现，IAA含量的小高峰出现的时间与根原基启动分化形成的时间相一致，说明根原基的启动分化阶段需要有较高浓度的内源IAA^[36]。本研究发现，雷公藤的幼叶、愈伤组织以及悬浮细胞在外源激素IBA，NAA处理下均可诱导形成不定根，并建立稳定的不定根培养体系，但关于外源激素对雷公藤不定根形成的机制问题有待于进一步研究。

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