烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶对血管疾病病理过程的影响
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[摘要] 氧化应激是一种活性氧（ROS）代谢引起的分子失调，以一氧化氮生物利用度下降为特征。使用抗氧化维生素E和维生素C对心血管疾病无明显疗效，这使得对氧化应激的分子本质的理解产生了变化。氧化应激不再被认为是产生和消除ROS之间的不平衡，而是酶功能的异常，特别是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶功能的异常。因此，NADPH氧化酶已成为重要的治疗靶点。为了设计正确的抗氧化治疗方案，必须考虑NADPH氧化酶的分子调节作用，以及新型该家族人类同源物Nox1、Nox2、Nox3、Nox4和Nox5。通过发展和评估可靠的局部和系统抗氧化应激技术抑制NADPH氧化酶，可能比使用抗氧化剂非选择性消除所有ROS更加有效。
[中图分类号] R544.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）08（a）-0043-05
Influence of NADPH oxidases on vascular disease pathological process
SUN Tao1 YANG Mengmeng1 ZHU Baoyi2 ZHANG Yan1
1.Department of Pharmaceutical， Tangdu Hospital， the Fourth Military Medical University， Shaanxi Province， Xi'an 710038， China； 2.Department of Ophthalmology， Tangdu Hospital， the Fourth Military Medical University， Shaanxi Province， Xi'an 710038， China
[Abstract] Oxidative stress is a molecular dysregulation in reactive oxygen species （ROS） metabolism， which is characterized by a loss of nitric oxide bioavailability. It is shown there is no clinical benefit of antioxidant vitamin C or vitamin E treatment for vascular disease， which has changed the understanding of the molecular nature of oxidative stress. Oxidative stress is no longer perceived as a simple imbalance between the production and scavenging of ROS， but as a dysfunction of enzymes involved in ROS production， especially the dysfunction of NADPH oxidases. Thus NADPH oxidases are important therapeutic targets. In order to properly design trials of antioxidant therapies， molecular aspects of NADPH oxidase regulation must be considered， while thinking about novel pharmacological targeting of this family of enzymes consisting of several homologs Nox1， Nox2， Nox3， Nox4 and Nox5 in humans. The development of reliable techniques for the assessment of local and systemic oxidative stress may be potentially much more efficient than non-selective scavenging of all ROS by the administration of antioxidant.
[Key words] Oxidative stress； NADPH oxidases； Vascular disease； Molecular mechanism
活性氧（ROS）是细胞中调控许多生理和病理过程的重要分子。ROS涉及正常细胞功能和疾病发展的机制，消除ROS的策略必须考虑到它们对器官正常功能的关键性影响。然而，过量的产生ROS涉及到很多疾病。动物模型和临床研究均证实血管壁中过量产生的ROS与动脉粥样硬化、心衰、高血压和斑块的稳定性密切相关[1]。一般而言，有两种清除自由基的方式：①给予抗氧化剂或刺激内源性抗氧化系统消除自由基；②通过抑制产生ROS的酶干扰氧化应急激的发生。第一种方式已被广泛用于基础和临床研究，然而却没有获得预期的对心血管系统的保护作用；而后一种方式被认为可提高血管功能，但需进一步明确潜在的机制和氧化应激的本质。
1 氧化应激的损伤作用
ROS对心血管系统的病理作用源于其对血管细胞功能的影响，及其可消除某些血管保护性成分。内皮释放的舒张因子（EDRF）和超氧阴离子（O2-・）之间的相互作用发生非常迅速，这使得一氧化氮（NO）没有机会发挥生物作用。目前认为这种相互作用是内皮功能异常的最常见机制，该机制使血管内皮细胞不能为血管壁提供血管保护性因子[2-3]。ROS对血管平滑肌细胞和纤维母细胞的直接作用在心血管疾病的早期阶段也发挥重要作用。一些ROS对血管可发挥直接调节作用，另一些ROS通过对蛋白、脂质和DNA的毒性氧化而发挥调节作用。过量产生的ROS导致血管再生和细胞增殖，同时激活大量的前炎症基因[4]。此外，ROS也在关键的信号通路中发挥作用。在生理浓度时ROS激活受体酪氨酸激酶和转录因子诱导抗氧化基因的表达，伴随着其他氧化还原敏感性转录因子的活化，影响细胞和组织的功能[5]。
2 抗氧化维生素缺乏临床有效性
离体和动物研究均证明维生素E、维生素C和维生素A具有抗氧化活性[6-7]，同时考虑到ROS在心血管系统疾病中的作用。因此，引入抗氧化维生素用于血管药理学研究是合理的。然而，随机临床研究所得数据却具有争议性。糖尿病、高胆脂醇血症、高同型半胱氨酸血症患者和吸烟者给予抗氧化剂可以改善血流介导的舒张（FMD）和血管内皮功能异常[8]。但是，进一步研究显示单一消除ROS不能有效地阻止心血管疾病的病理过程[9]。多中心临床研究没有证实维生素E在动脉粥样硬化病理过程或主要心血管事件中的保护作用。事实上，Meta分析揭示给予维生素E的剂量超过400 IU/d可能增加心血管疾病患者的死亡风险[10]。
抗氧化剂清除ROS缺乏临床有效性的可能原因。抗氧化剂可消除部分ROS，但不能消除过量产生的ROS，因此整个病理过程依然可以继续。此外，抗氧化剂，包括维生素，与O2-・之间的相互作用比NO慢一百万倍。结果，超氧自由基与NO的相互作用是一个热力学的过程，导致了NO生物活性的丧失。也有研究显示维生素不能充分渗入血管壁，因此它们可能在血浆中达到治疗水平，但在组织中不能达到治疗水平。最后，维生素E和O2-・相互作用可以形成自由基。这种自由基分子在给予维生素C或辅酶Q的情况下可转变为维生素E。然而，研究证实联合使用维生素E和C不能增强临床有效性。
由于临床研究没有证实抗氧化维生素治疗心血管疾病的有效性，这使人们意识到现有关于氧化应激的理解可能并不完全正确。然而，在考虑治疗心血管疾病时依然不能忽视它们[11]。
3 氧化应激发生的复杂分子机制――烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的中心作用
ROS主要来源于氧化还原酶，如NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）氧化酶、黄嘌呤氧化酶、脂氧化酶和环氧合酶。同时，应该注意到这些来源（酶）之间的相互影响。目前认为NADPH氧化酶和黄素氧化酶将O2转化为O2-・是这些事件的中心环节。产生ROS的氧化酶可以被其他来源的ROS修饰。一些氧化酶结构的变化导致NADPH氧化酶产生过量的ROS，而过量的ROS导致它们功能的异常，并进一步促进ROS的生成，形成氧化应激的恶性循环（图1）。例如，巯基可逆的氧化随后发生不可逆的蛋白水解修饰，转换黄嘌呤脱氢酶（参与嘌呤代谢）转变为产生ROS的黄嘌呤氧化酶。这种转变导致了分子量明显的变化（图1）。这种现象在许多血管疾病状态、糖尿病、动脉粥样硬化中被发现[3，12]。
许多因子如血管紧张素Ⅱ、内皮素、氧化LDL（Ox-LDL）、生长因子、细胞因子、趋化因子和血流紊乱可以增加NADPH氧化酶活性，导致超氧自由基的产生。O2-・含量的增加导致血管壁的变化和内皮功能异常的发展。ROS的产生也依赖其他细胞氧化酶如黄嘌呤氧化酶或eNOS[5]
图1 NADPH氧化酶在血管氧化应激和内皮功能异常发病机制中的中心作用
ROS具有平行双向活性，Nox蛋白可以发挥保护和损伤作用。ROS是调节血管张力、基因表达、增殖、迁移和分化的重要信号分子。另一个方面，心血管危险因素和血管疾病促进ROS的产生而加快动脉粥样硬化、血管功能异常、高血压、血管肥大和血栓的病理过程。因此，有效地抑制NADPH氧化酶对于理解其结构、活性和功能非常重要[13]。
4 NADPH氧化酶结构和激活
NADPH氧化酶家族包括多个同源物，它们的表达、结构和功能各异。简要来说，这些同源物包括Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、Duox1和Duox2。Nox亚型包含一个FAD和NADPH结合位点，两个血红素分子和6个跨膜结构域。Duox亚型也包含同样的结构域；然而，有一个7次跨膜的结构域并具有过氧化物酶同源性[14]。
NADPH氧化酶在不同的血管细胞中的表达各异。Nox1和Nox5分别主要表达于血管平滑肌细胞和内皮细胞[15]。Nox2在内皮细胞、外膜纤维细胞和血管平滑肌细胞中被发现。而上述所有细胞中均有Nox4的表达。重要的是在特定情况下，不同的类型细胞中一种以上的Nox亚型被激活，而促进氧化应激的发生，并且在一些情况下不同的Nox亚基可能相互作用。Nox3主要表达于内耳，包括螺旋神经节、耳庭和耳蜗上皮细胞。Duox1和Duox2表达水平很高，特别是在甲状腺，参与了甲状腺激素的氧化[14]。同系物分布部位的不同可能与它们在健康和疾病中发挥的作用不同相关。血管NADPH氧化酶，特别是Nox1、Nox2和Nox5，通过单一电子转移产生ROS而主要产生O2-・。Nox4是一个例外，因为它的E环有一个特殊的改变，可以产生过氧化氢H2O2，尽管Nox4的生物学特征依然有争议。H2O2是一个重要的血管扩张剂，它可以产生内皮依赖性舒张反应，并可降低小鼠的血压。H2O2可增加内皮细胞NOS的表达和活性，并可直接氧化蛋白激酶Giα亚基，产生血管舒张作用[15]。此外，目前认为Nox不同亚型在动脉粥样硬化的发展过程中表达的部位不同。Nox4可以增加动脉粥样硬化斑块的稳定性，在斑块发展的早期阶段Nox2似乎对动脉粥样硬化的进展起关键作用，而Nox5也可表达于人类动脉粥样硬化斑块不稳定的位置[16]。
5 NADPH氧化酶信号通路和调节的复杂性
NADPH氧化酶的活性可被因子、激素、剪切应力、血流停止、凝血酶、5-羟色胺、内皮素-1、血管紧张素Ⅱ、组胺、缓激肽、溶血磷脂酸、佛波醇（PMA）、前列腺素F2α（PGF2α）和鞘氨醇1-磷酸等所影响。近期的研究重点是葡萄糖的刺激作用、高级糖化产物（AGE）、非酯化脂肪酸（NEFAs）、肿瘤坏死因子和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）对NADPH氧化酶活性和表达的影响[17-18]。
刺激细胞膜表面的受体，如血管紧张素Ⅱ受体，可激活NADPH氧化酶。血管紧张素Ⅱ结合AT1受体后导致磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D（PLD）的激活。两者都可以产生二酰甘油（DAG），而PLC还可以产生三磷酸肌醇（IP3）。DAG和IP3诱导了钙离子的释放，而激活蛋白激酶C（PKC）。PKC磷酸化p47phox亚基需要其他因子与该亚基的结合，而激活NADPH氧化酶。NADPH氧化酶同样也可以通过脂性第二信使激活氧化酶[17]。
同样有一些反馈机制使NADPH氧化酶的调节更加复杂。例如，过氧化氢激活c-Src（酪氨酸激酶，分子伴侣v-Src），这可能通过激活c-Abl或导致表皮生长因子受体（EGFR）反式激活（激活PI3-激酶产生PIP3）增强NADPH氧化酶活性，而对ROS的产生起正反馈作用。值得注意的是虽然NADPH氧化酶影响其他氧化酶产生的ROS，而它们自身的活性也可以被其他氧化酶产生ROS所影响[19]。
6 NADPH氧化酶激活的分子后果
超氧阴离子，NADPH氧化酶主要的产物，与NO反应产生过氧硝酸盐，这是内皮功能异常的主要特征性机制[20]。超氧阴离子可自发或酶促变为更稳定的H2O2。过氧化氢可被转化为活性氮和活性氯而攻击LDL和HDL，促进斑块的形成[21]。H2O2可影响蛋白激酶和磷酸酶。H2O2通过钝化磷酸酶和激活一些蛋白激酶调节蛋白的磷酸化。一个公认的例子是细胞内ROS的增加可能抑制酪氨酸磷酸酶，并增加酪氨酸激酶活性。这可能导致丝裂原激活蛋白激酶（MAPKs）磷酸化。而Akt激酶（IP3-激酶下游）和半胱天冬酶-3激活涉及细胞凋亡过程，并被ROS调控[22]。
ROS主要通过在DNA结合域的关键氨基酸残基上形成二硫键调控转率因子活性或间接通过调节氧化还原信号通路（磷酸化/去磷酸化）而发挥作用。激活的蛋白-1（AP-1）通过MAPKs和NF-κB通路发挥作用，特别是通过ERK1/2和c-jun N-端蛋白激酶（JNKs）导致前-炎症基因的表达，伴随细胞因子和趋化因子的生产[23]。而NF-κB可诱导E-选择素、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的表达而涉及单核细胞黏附到内皮细胞和它们的激活[24]。
除了调节细胞内的信号通路之外，ROS促进了DNS、脂质和蛋白的损伤。ROS诱导DNA损伤激活poly（ADP-核糖）聚合酶（PARP），导致PKC激活和进一步增强NF-κB的活性[25]。
在上面描述的信号通路，涉及其他中间蛋白，如细胞内还原因子（谷胱甘肽、过氧化氢酶、氧化酵素和SOD）[26]。
通过这些分子机制，ROS影响血小板聚集、单核细胞迁移、脂质过氧化和氧化还原敏感性基因的表达。ROS也涉及调节内皮功能异常、血管平滑肌细胞（VSMC）生长、增殖、分化、凋亡、迁移和免疫反应。说明这些潜在的机制是发展新型治疗动脉粥样硬化和血管功能异常药物最重要的第一步。
7 NADPH氧化酶靶点
激活NADPH氧化酶涉及复杂的机制，这些酶以不同活性水平被激活。首先，降低NADPH氧化酶的表达可以抑制其活性。通过阻断其细胞溶质亚单位转移到细胞膜也可以降低NADPH氧化酶的活性。其他方式可能为通过使用PKC抑制剂阻止p47phox亚单位磷酸化，或通过阻止p47phox亚单位结合到其他亚单位。此外，通过减少信号传导和抑制Rac1移位已经被证实可以减少ROS的产生[5]。最后，需要特别重视的是策略目标不应该是抑制所有已知的氧化酶，而是抑制特定的NADPH氧化酶亚型。这些靶点可以帮助指导研究新型的NADPH氧化酶抑制剂。
ROS在调控血管组织的许多生理和病理过程中发挥重要作用。近年随着对氧化应激本质认识的深入，对ROS在血管疾病中的意义也有了进一步的理解。NADPH氧化酶是血管中ROS的主要来源，因此对NADPH氧化酶的研究，将揭示血管疾病新的病理生理机制和防治途径。
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（收稿日期：2015-01-02 本文编辑：苏 畅）