HPV58型E67融合基因腺病毒载体构建

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摘要：目的：构建hpv58亚型E6-E7融合基因腺病毒载体，并制备HPV58亚型E7基因多克隆抗体。 方法：通过RT-PCR和PCR技术从宫颈癌病人活检组织总RNA中扩增HPV58E6和E7基因片段，去除E6终止密码子和E7起始密码子，连入过渡质粒pCDNA3.1（-），形成HPV58e67融合基因， 扩增E67融合基因片段后连入T载体，应用Takara MutanBEST Kit试剂盒定点突变HPV58E67基因去转化活性后再连接到穿梭质粒pshuttle2，构建腺病毒载体。 结果：成功构建HPV58E67融合基因腺病毒载体 。结论：近一步研发对人体行之有效的HPV16，18，58三价治疗性疫苗打下基础

关键词：人瘤病毒HPV58亚型;E6-E7融合基因;腺病毒载体;定点突变

高危型人类瘤病毒（HPV）感染是诱发宫颈癌的首要启动因素。目前临床宫颈癌传统方法疗效不佳，因此近10年来HPV疫苗研究非常活越。研究表明，高危型HPV16，18感染宿主细胞后，整合后的HPV DNA的早期开放阅读框架E2、E6和E7基因是发生致癌作用的主要基因。根据我国HPV感染亚型的分布特点，本实验选择HPV16、18、58这三个最常见的亚型（涵盖国内80%以上的宫颈癌HPV感染病例，东南部比例更高）中的58亚型，构建了其E6-E7融合基因，通过定点突变方法去除转化活性后重组入腺病毒载体，为下一步获得对人体行之有效的HPV16，18，58三亚型治疗性候选疫苗打下基础。

1材料和方法

1.1模板、菌株和载体

HPV58基因组全长由自行扩增宫颈癌患者活检组织（由深圳市中医院检验科提供）获得。中介质粒载体pMD18T Simple购自TaKara。pCDNA3.1（-），Adeno-X腺病毒载体系统（BD Clontech），含pShuttle2及pAdeno-X质粒，Pet28a质粒等，由清华大学深圳研究生院黄来强教授实验室惠赠。

1.2主要试剂

限制性内切酶I-ceuI、PI-SceI、PacI、SwaI购自NEB公司，其余各种工具酶，点突变试剂盒，DNA及点突变试剂盒购自Takara公司。小鼠抗人HPV 58E7单抗购自GeneTex公司，小鼠抗人HPV单抗购自Santa Cruz公司，HRP标记的羊抗小鼠IgG及化学发光检测试剂购自上海华美生物公司，LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒购自Gibco。

1.3 HPV58E67基因的获取

Trizol法提取组织总RNA， RT-PCR扩增获得HPV58开放阅读框全长， 根据GeneBank中公布的HPV58亚型E6，E7基因序列设计扩增引物，PCR扩增HPV58亚型E6，E7基因，PCR产物经纯化，去除E6终止子、E7启动子，酶切后按设计的酶切位点，连接过渡质粒pCDNA3.1（-）并形成融合基因，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性质粒酶切鉴定并送上海英骏公司测序。

1.4 突变引物的设计与合成

根据 HPV58基因序列和实验目的设计扩增突变引物（表1），由上海英骏公司合成

表1 引物设计

1.5 目的基因的扩增、突变及重组腺病毒载体构建

上述构建的重组质粒PCR扩增E67融合基因，PCR产物纯化后连接pMD18T Simple， 将上一步回收的DN段用Takara Ligation Mixture连入质粒pshuttLe2NheⅠ和XbaⅠ位点之间，将重组pshuttLe2质粒分别以内切酶PI-SceI和I-CeuI进行双酶切，回收的DN段用Takara Ligation Mixture连入质粒Adeno-X，连接产物用SwaI酶切后转化DH5，PCR，酶切鉴定，并送上海英俊公司测序。

1.6外源蛋白表达鉴定

PacI酶切线性化pAdeno-X DNA，脂质体转染HEK293细胞，常规37℃、5%CO2继续培养至细胞出现明显病态效应后，常规Trizol法提取细胞蛋白，以小鼠抗人HPV（含58型）单抗为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，Western Blotting分析外源基因表达情况。

2结果

2.1 HPV58E67基因的获取

PCR扩增V58E6，E7基因，结果（图1）与预期一致，测序结果与GenBank中公布的相应序列（NC001443）比对完全一致。产物经纯化，E6终止子、E7启动子去除，按设计的酶切位点连接DNA3.1（-）成过渡质粒，对过渡质粒进行酶切鉴定，得到5.4kb大小的载体片段和约800bp的目的片段，鉴定结果如图2，提示过渡质粒构建成功。

图1 M为Marker 1-2

图2 过渡质粒酶切鉴定电泳图

HPV58E6，E7扩增片段

2.2 HPV58 亚型mE67基因的获得

HPV58E67基因连入pMD18T simpLe vector进行四轮定点突变。第一轮为E6基因与P53的结合位点的突变，第二轮E6基因锌指结构（Cys-X-X-Cys）的突变，第三轮为E7基因与Rb（L-X-C-X-E）结合位点的突变，第四轮为E7基因锌指结构（Cys-X-X-Cys）的突变。突变结果如图3。其中左侧为PCR电泳图，右侧为相应的突变引物（下划线为突变位点）及用vector软件进行的突变测序结果与野生型序列比对。提示四轮突变全部成功完成。

2.3重组腺病毒载体构建及外源蛋白表达鉴定

将HPV58mE67经PCR扩增后连入穿梭质粒pshuttle2，重组pshuttLe2质粒以内切酶PI-SceI和 I-Ceu I进行双酶切，将所得目的片段连入腺病毒载体，以所构建的重组腺病毒载体为模板，用腺病毒引物PF/PR（试剂盒自带）均扩增出287bp条带（图4）。提示携带目的基因的重组腺病毒载体构建成功。进一步Western Blotting分析结果（图5）提示，转染细胞中相应亚型的E6，E7蛋白均有表达。结果中出现多条带（估算为27、35、43KD左右），有文献报导[1] “E7电泳条带与其计算分子量大小可能不符”（E6计算分子量17KD，E7计算分子量11KD，但E7条带经常位于20KD附近等处）。其中，27KD条带与融合蛋白计算分子量大小接近（17+11），所占比例最大的35KD条带正好与E7习惯位置相符（17+20）。

图4 重组腺病毒的PCR鉴定

图5外源蛋白表达western bLot鉴定图

讨论

不同地区HPV感染型别构成比是存在差异的。HPV58型在国外罕见而在我国的感染非常普遍，在宫颈癌患者中的检出率直追HPV16，高达33.3 %[2]，在很多地区甚至持平[2]。本实验根据我国HPV感染亚型的分布特点，选择HPV58构建腺病毒载体，为进一步研发最常见的亚型治疗宫颈癌的多价疫苗HPV16，18，58打下了基础。研究表明，高危型HPV的E6、E7是公认的致癌因子，在HPV 相关的永生化和致瘤性中起着重要作用，本实验综合了文献[3-4]的方案，对E6基因，选择突变其P53结合位点及一个锌指结构（Cys-X-X-Cys），E7基因突变其Rb结合位点和一个锌指结构（Cys-X-X-Cys），在尽可能不影响蛋白稳定性和免疫原性的前提下，彻底去除其转化活性。本实验根据疫苗设计特点，通过分子生物学手段对腺病毒载体进行相应的优化，如缺失腺病毒非必需基因以扩大外源基因容量、通过突变/酶切消除了靶基因转化活性，但保留了抗原靶位;构建分子量更大的融合蛋白增加了抗原性，为后续HPV16，18，58三价疫苗课题的研发工作打下基础。

参考文献：

[1] Chan PK， Li WH， Chan MY， etal. High prevalence of human papillomavirus type 58 in Chinese women with cervicaL cancer and precancerous Lesions [J]. J Med ViroL，1999，59（2）：232-238.

[2] Huang S ， Afonina I ， MiLLer BA ， etal. Human papiLLoma virus types 52 and 58 are prevalent in cervicaL cancers from Chinese women [J]. Int J Cancer， 1997， 70：4082411.

[3]罗利群，李洁，刘绣等. HPV58型E7基因重组痘苗疫苗免疫保护作用的实验研究[J].中国医学科学院学报，2003，25（1）：43-46

[4]HPV 18 E7 protein requires intact Cys-X-X-Cys motifs for zinc binding， dimerization， and transformation but not for Rb binding[J]. J Virol， 1993， 67（6）：3142