电聚合制备三聚氰胺分子印迹QCM传感器薄膜及其表征研究
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摘 要：通过研究得出，在聚合电压U为0～1.6V、聚合段数为22、模板三聚氰胺（MEL）浓度为4mmol/L、单体甲基丙烯酸（MAA）浓度为10mmol/L、成膜剂邻苯二胺（o-PD）浓度为18mmol/L条件下，以pH 8.0的BR缓冲液作为溶剂和电解液，用电聚合方法，直接在石英晶体微天平（QCM）传感器电极上修饰的分子印迹薄膜，其对目标分子MEL具有良好的频率表征效果，频移值为59Hz。通过相同3个修饰电极的频率表征变化来看，电极对目标分子的识别表征极不稳定。这与手动进样方式、环境较大噪声和电极本身差异密切相关，难以建立对目标分子的标准曲线（r=0.966）实现准确定量分析。
关键词：三聚氰胺；分子印迹膜；石英晶体微天平；传感器；电聚合
Electropolymerization for Preparation of Melamine Molecularly Imprinted QCM Sensor Membrane and Its Characterization
ZHANG Xiao-gang，TAI Hong-xing，TIAN Yan-li，ZHU Qiu-jin*，HU Ping
（Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store and Processing of Guizhou Province， College of Life Science，
Guizhou University， Guiyang 550025， China）
Abstract：Molecularly imprinted membrane for direct modification of QCM sensor electrode was prepared by electropolymerization using BR buffer （pH 8.0） as the solvent and the electrolyte solution under the conditions of 01.6 V， 22， 4 mmol/L， 10 mmol/L and 18 mmol/L for polymerization voltage， the number of polymeric segments， template （melamine， MEL） concentration， monomer （methacrylic acid， MAA） concentration and o-PD （film-forming agent） concentration， respectively， The prepared membrane had good performance for frequency characterization of MEL with frequency shift of 59 Hz. Three replicates of the modified QCM sensor electrode showed variations in frequency characterization， suggesting its very poor stability， which may be closely related to manual sampling， the high level of environmental noise and the electrode itself. As a result， it is hard to establish a standard curve for accurate quantification of melamine.
Key words：melamine （MEL）；molecularly imprinted membrane （MIM）；quartz crystal microbalance （QCM）；sensor；electro-polymerization
中图分类号：O657.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）01-0011-06
石英晶体微天平（quartz crystal microbalance，QCM）是以石英晶体为换能元件，利用石英晶体的压电效应，将待测物质的质量信号转换成频率信号输出，从而实现质量、浓度等检测的仪器。其测量精度可达纳克级，具有结构简单、分辨率高、灵敏度高、特异性好、可实时在线监测等优点[1]，被广泛应用于物理、生物、化学和医学等各个领域[2-3]。然而，石英晶体微天平与分子印迹技术相联合，充分利用了石英晶体微天平和分子印迹聚合物的预定性、特异识别性优点，可为开发新型高灵敏度传感器检测技术提供一个可靠的方向。目前分子印迹技术修饰石英晶体微天平的方法主要有相转化法、电聚合技术和原位聚合法。相转化法利用成膜剂将预先制备好的，对目标分子具有高特异性识别和容量的分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer， MIP）固载到晶体电极金表面，可以有效地保证薄膜对目标分子具有特异识别作用，制备方法简单。但对制膜技术要求颇高，目前研究取得了很大的成效[4-9]。电聚合制备分子印迹传感器薄膜可以在任何形状的金属表面聚合得到紧密的聚合膜，膜的厚度可以通过电聚过程聚合液浓度和电聚合扫描圈数等参数进行很好的控制[10-13]。如：以多巴胺为功能单体和交联剂，过硫酸铵为氧化剂，在QCM晶振片表面制备对软骨藻酸具有特异性识别能力的聚多巴胺分子印迹膜[14]，聚邻苯二胺分子印迹纳米膜（iPPD）的制备[15]，以及电极修饰后制备单糖荧光传感器[16]等的制备。原位聚合法[17-19]与电聚合相类似，它将预先配制好的聚合液滴加到传感器电极表面，然后利用紫外光、或靠分子间相互作用力进行膜引发沉积，再将模板分子和未反应物质洗脱即得到对应传感器修饰电极。但无论是那种技术，膜的均匀性、稳定性，对目标分子精确定性和定量的表征还需进一步研究。
本实验以三聚氰胺（melamine，MEL）为模板分子、甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）为单体、邻苯二胺（o-phenylenediamine，o-PD）为成膜剂，电聚合制备三聚氰胺分子印迹石英晶体微天平传感器薄膜，并对薄膜进行频移表征研究，分析薄膜制备中的CV曲线和对应频率变化曲线，探讨印迹膜形成和识别机制。为建立新型、高灵敏度三聚氰胺qcm检测技术提供基础数据和阐明其检测识别原理。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
三聚氰胺、甲基丙烯酸（纯度均大于99.9%） 美国Sigma-Aldrich公司；邻苯二胺 成都格雷西亚化学技术有限公司；硼酸、醋酸、磷酸、氢氧化钠均为分析纯；氮气（≥99%）。
1.2 仪器与设备
HB 3120U超声波清洗仪 江苏汉邦科技有限公司；CHI440b石英晶体微天平（CHI125A先镀钛再镀金的晶体电极，CHI127 EQCM电解池，CHI128 Ag/AgCl Reference Electrode for EQCM，CHI129 Pt Counter Electrode for EQCM） 上海辰华仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 晶体金电极清洗
石英晶体金电极金表面用Piranha溶液（30% H2O2，70% H2SO4）清洗。具体操作：先将Piranha溶液少量滴加在晶体电极中央使其覆盖金片部位（避免与两端接触点的弹簧丝和银浆长时间接触而腐蚀），浸泡15min。然后用自制平滑摸擦橡胶头轻轻擦洗电极表面10s（不能过硬和有菱边），再用自来水将洗液冲洗干净，用洗耳球吹干电极表面。循环上述过程1次，再滴加Piranha溶液浸泡15min，然后用去离子水冲洗电极表面至中性后，氮气吹干置于干燥器内放置3h以上备用。
1.3.2 BR缓冲液配制
配制0.04mol/L的磷酸、硼酸和醋酸混合溶液，然后用10mol/L NaOH溶液调节缓冲液pH值为8.0，即得pH值为8.0的BR缓冲液。
1.3.3.1 电聚合液配制
配制一定浓度MEL、MAA、o-PD的BR缓冲液（pH8.0）混合溶液，氮气除氧5min密封，于（16±1）℃静置3h以上（不超过5h）备用（空白聚合液制备除不加MEL外，其余处理完全相同）。
1.3.3.2 传感器薄膜的聚合
将电极固定于洗净干燥的电解池内，吸取3.00mL聚合液，接好电解池进行CV电聚合。
1.3.3.3 传感器薄膜模板分子洗脱
将电解池内聚合后的聚合液倒出，用少量去离子水清洗电解池（不取出电极），然后加入约2mL甲醇-乙酸（体积比9：1）混合液，浸泡10min换1次洗液，清洗3次后用大量的去离子水冲洗电解池和电极，然后用氮气吹干，置于干燥器内放置过夜进行表征。
1.3.4 传感器薄膜表征
向固定有修饰的石英晶体传感器金电极的电解池中添加2.00mL BR缓冲液（pH8.0），接通电解池，进行石英晶体微天平频移表征。待400s内频移不超过2Hz后先加入100μL BR缓冲液（pH8.0），再待400s内频移不超过2Hz后加入100μL 20mmol/L MEL BR缓冲液（pH8.0）进行频移表征，直至频移稳定。
1.3.5 标准曲线测定
用20mmol/L 的MEL BR缓冲液母液，以BR缓冲液配制4、8、12、16、20mmol/L的MEL标准工作液。同时在相同条件下制备5个修饰石英晶体电极进行对应浓度工作液表征（方法同1.3.4节）。然后以MEL浓度为横坐标，频移值为纵坐标绘制标准曲线。
1.4 数据分析
表征结果均为平行测定3次取平均值整数，表示为±s。统计分析采用Orthogonality Experiment Assistant 3.1、Origin Lab Origin V8.0软件。
2 结果与分析
2.1 电聚合制备薄膜的优化及表征
以MEL为模板、MAA为单体、o-PD为交联剂成膜剂，BR缓冲液（pH8.0）溶剂，预先将各物质按一定配比混合溶解，使各物质间在电聚合相同温度条件下充分组装得到电聚合液，在电引发下，使o-PD相互聚合，沉积于金薄片表面，尽而将模板与单体的复合物固定，形成包含模板分子的印迹聚合物薄膜，再通过高极性溶液使模板分子从聚合物中洗脱即得到对目标分子具有特异性识别位点的分子印迹聚合物薄膜。
2.2 电聚合过程晶体金电极响应特性
2.2.1 聚合过程CV扫描响应曲线
石英晶体微天平（QCM）可进行纳克级的质量测量。在适当的条件下，石英晶体上沉积的质量变化和振动频率移动之间呈简单的线性关系（Sauerbrey公式）[20]。
Δf = -2fo2Δm/[A・（μρ）2]
式中：fo是晶体的基本谐振频率/MHz；A是镀在晶体上金盘的面积/cm2；ρ是晶体的密度（为2.684g/cm3）；μ是晶体切变系数（为2.947×1010g/（cm・s2））。对于本实验晶体（fo = 7.995MHz，A = 0.196cm2），每赫兹的频率改变相当于1.34ng。所以，厚度是QCM频率变化的决定因素，当QCM表面有物质变化时（增加或减少）都可导致器件厚度的变化，进而引起共振频率的变化。
c（MEL）=2mmol/L，c（MAA）=8mmol/L，
c（o-PD）=20mmol/L，聚合电压1.6V，扫描24段（12圈）。
图 1 电聚合过程典型CV曲线
Fig.1 Typical CV curve of electropolymerization process
由图1可知，随着CV扫描的进行，在第1圈的电压升阶段（第1段N=1），随着电压的增加，在0.621～0.628V出现了最大氧化峰电流。而在电压降阶段（第2段N=2），随着电压的降低，在0.259V出现了最大氧化峰电流。持续扫描时，随着扫描的循环进行，最大正值氧化峰电流消失，最大负值氧化峰电流持续减小，从其间具体氧化峰电流看有略微的升降波动。CV扫描曲线特征可以看出，随着伏安循环扫描，成膜剂o-PD在金电极表面迅速（N=1）发生聚合形成低导电薄膜，进而增加了电极的电阻，使电流减小。由于膜的聚合形成和部分膜的过度氧化使氧化峰电流出现细微的波动，但薄膜形成速度始终大于过度氧化速度。其对应频率响应曲线如图2所示。
图中从上至下为CV扫描各段的频率响应对应曲线。
图 2 电聚合过程典型CV曲线的同步频移曲线
Fig.2 Synchronous frequency shift in the typical CV curve of electropolymerization process
由图2可知，随着聚合的进行，电极表面响应频率持续下降，说明电极表面进行了连续的聚合，膜厚度持续增加，因此电极的导电性能也相应下降，实现了电极表面传感器薄膜的电聚合。
2.2.2 典型表征频移曲线
图 3 传感器薄膜典型表征频率F-时间t曲线
Fig.3 Typical curve of characterization frequency （F） versus time （t）
由图3可知，传感器薄膜频率响应曲线看出，薄膜在加入背景溶液后并没有出现频率响应，而当加入样品液时频率下降，最后达到平衡，说明传感器薄膜对目标分子实现了识别。电聚合制备修饰电极在加样后600s内频率响应变化较慢，其后1000s内频移较大，最后达到平衡，整个响应过程时间为1600s。
2.2.3 单因素试验
通过配制一定浓度的聚合溶液对电聚合过程中聚合电压（U）、聚合段数（N）、单体MAA浓度、成膜剂o-PD浓度和模板MEL浓度进行优化，选择最优电聚合石英晶体微天平传感器薄膜条件。
2.2.3.1 聚合电压对印迹薄膜的影响
a.电聚合薄膜时晶体电极频率变化；b.电极对目标分子的响应频率变化。图5～8同。
图 4 聚合电压对印迹薄膜的影响
Fig.4 Effect of polymerization voltage on molecularly imprinted membrane
配制2mmol/L MEL、6mmol/L MAA、16mmol/L o-PD的聚合液进行印迹薄膜的制备（CV聚合22段）和表征，聚合电压选择和表征结果如图4所示。可以看出，随着聚合电压的升高，电聚合时晶体金电极频移增大，但标准偏差较大，说明电极表面聚合沉积薄膜越厚，但膜厚度不均。而从表征频率来看，当聚合电压在0～1.6V时，薄膜对目标分子的响应最大，达（75±8）Hz。
2.2.3.2 聚合段数对印迹薄膜的影响
图 5 聚合段数对印迹薄膜的影响
Fig.5 Effect of number of polymeric segments on molecularly imprinted membrane
配制2mmol/L MEL、6mmol/L MAA、16mmol/L o-PD的聚合液，在0～1.6V进行CV法印迹薄膜的制备和表征，聚合段数的选择和表征结果如图5所示。随着聚合段数的增加，电聚合时晶体电极频移增大，电极表面聚合沉积薄膜越厚。而从表征频率来看，当聚合22段时，薄膜对目标分子的响应最大，达（75±8）Hz。
2.2.3.3 聚合单体MAA浓度对印迹薄膜的影响
图 6 单体MAA加入量对印迹薄膜的影响
Fig.6 Effect of monomer concentration on molecularly imprinted membrane
配制2mmol/L MEL、16mmol/L o-PD和MAA浓度分别为0、4、6、8、10、12mmol/L的聚合液，在0～1.6V进行CV扫描电聚合22段（11圈），然后进行表征，聚合液单体MAA浓度的选择和表征结果如图6所示。从图中看出，随着单体浓度的增加，电聚合时晶体电极频移出现波动。而结合膜表征频率可知，当MAA浓度为8mmol/L时，薄膜对目标分子的响应最大，为（99±9）Hz。电聚金晶体电极频移并不是最大，处于相对较小值（2213±195）Hz。说明，不同单体加入量与模板和成膜剂间相互作用影响了膜的结构和聚合，膜厚度不一。
2.2.3.4 聚合液成膜剂o-PD浓度对印迹薄膜的影响
配制2mmol/L MEL、6mmol/L MAA和o-PD浓度分别为8、12、16、20、24mmol/L的聚合液，在0～1.6V进行CV扫描电聚合22段（11圈），然后进行表征，聚合液单体MAA浓度的选择和表征结果如图7所示。当成膜剂o-PD为20mmol/L时，薄膜对目标分子的响应频移最大，为（103±15）Hz。此时对应电聚合晶体金电极频移为最大，为（2427±190）Hz。
图 7 成膜剂o-PD加入量对印迹薄膜的影响
Fig.7 Effect of o-PD concentration on molecularly imprinted membrane
2.2.3.5 聚合液模板MEL浓度对印迹薄膜的影响
图 8 模板MEL加入量对印迹薄膜的影响
Fig.8 Effect of melamine concentration on molecularly imprinted membrane
分别配制0、1、2、3、4、5mmol/L MEL、6mmol/L MAA和16mmol/L o-PD的聚合液，在0～1.6V进行CV扫描电聚合22段（11圈），然后进行表征，聚合液模板MEL浓度的选择和表征结果如图8。当模板MEL浓度为2mmol/L，薄膜对目标分子的表征频移最大，为（75±8）Hz。此时对应电聚合晶体电极频移为最大，为（2116±382）Hz。
从单因素试验结果可以看出，在相同条件下制备3个修饰传感器薄膜，其标准偏差在170～462Hz。膜制备时各平行之间过大的标准偏差结果反应了各电极间可能的差异性导致所制备薄膜厚度的不稳定性。尽而影响后续频移表征，造成各薄膜表征频率标准偏差同样偏大，显示出各薄膜的不稳定性。但各不同聚合条件下所得薄膜对目标分子具有一定的识别作用，并显示出一定的规律性。
2.2.4 正交试验结果
2.2.4.1 正交试验设计与结果
经过单因素试验筛选后，确定五因素三水平进行正交试验优化，因此采用L18（37）正交表进行设计，其因素、水平表及结果如表1。所制备传感器薄膜同相转化法制备薄膜表征结果一样，均能够对目标分子实验特异性识别，然而各试验标准偏差同样较大。相同平行实验没有高的重复性，但也出现了一定的规律。
由于试验要求具有最高的频移为最好的效果，因此直观分析：F=59Hz频率降低最多。较好的试验条件：A2B2C3D1E2。均值极差分析：根据极差大小顺序排出因素的主次顺序为：RA>RE>RB>RD>RC，因素重要性从大到小依次为：聚合电压U>成膜剂o-PD浓度>聚合段数N>单体MAA>模板MEL浓度。根据均值最大进行筛选试验最佳制备传感器薄膜条件为：A2B2C3D3E2，即聚合电压1.6V、聚合段数N=22、模板MEL浓度4mmol/L、单体MAA浓度10mmol/L、成膜剂o-PD浓度18mmol/L。
2.2.4.2 正交试验方差分析
分别在0.05和0.01显著水平对正交设计试验结果进行方差分析，根据极差分析结果，误差列设为模板浓度和空列7。分析结果见表2。
由表2可知，在0.05显著水平聚合电压、聚合段数和成膜剂o-PD浓度对薄膜识别目标分子的频移影响显著。在0.01显著水平仅有聚合电压U对薄膜识别目标分子的频移影响显著。这与极差因素重要性分析结果聚合电压U>成膜剂o-PD浓度>聚合段数N>单体MAA>模板MEL浓度基本稳合。因此，聚合电压是最重要因素，其次为聚合段数和成膜剂浓度，单体和模板为次要影响因素。
2.2.4.3 标准曲线
根据正交试验结果最优制膜条件为：聚合电压0～1.6V、聚合段数N=22、模板MEL浓度为4mmol/L、单体MAA浓度为10mmol/L、成膜剂o-PD浓度为18mmol/L，在相同条件下制备5个传感器电极，对4、8、12、16、20mmol/L的MEL标准工作液进行频移表征。
当背景液为2mL，加样量为100μL，MEL在0～20mmol/L
范围内没能测得良好的线性关系：y=4.314+2.410x （r=0.966）。而且测定过程中仍然显示出较大的标准偏差。各次重复测定之间没有良好的重现性。
通过电聚合表征结果可知，各表征频移间标准偏差较大，在测定标准曲线时，无法建立良好的线性关系。后续更无法对实际样品中三聚氰胺进行预测和测定其检出限。分析其原因：1）表征过程中，在手动加入样品瞬间，晶体电极频率出现瞬时跳跃，可能会造成表征结果不稳定；2）表征环境的不定噪声、振动影响实验准确测量；3）通过电聚合过程相同条件薄膜制备的CV同步频率F-时间t曲线可知，电极个体差异性也导致了薄膜表征各平行间较大的标准偏差。基于此，要想得到理想的频率表征和成功建立标准曲线，实现对样品中三聚氰胺的精确定量仍需进一步研究和消除仪器和环境所造成的系统误差。
3 结 论
3.1 电聚合制备薄膜单因素试验结果知，在相同条件下制备3个修饰传感器薄膜，其聚合阶段频移标准偏差在170～462Hz。反映了各电极间可能的差异性，尽而导致所制备薄膜厚度的不稳定性，各薄膜表征频率标准偏差偏大。但各不同聚合条件下所得薄膜对目标分子具有一定的识别作用，并显示出一定的规律性。
3.2 电聚合薄膜最优制膜条件为：聚合电压0～1.6V、聚合段数N=22、模板MEL浓度为4mmol/L、单体MAA浓度为10mmol/L、成膜剂o-PD浓度为18mmol/L；最大表征频移为59Hz。
3.3 MEL频移标准曲线测定显示，当背景液为2.00mL，加样量为100μL，MEL在0～20mmol/L范围内没能测得良好的线性关系：y=4.314+2.410x （r=0.966）。
3.4 总体分析得知，所得薄膜对MEL均实现表征，并出现一定的规律，但所有的表征结果均显示出较大的标准偏差，检测结果极不稳定，无法在后续正交优化后建立标准曲线，不能达到对样品溶液的准确定量。主要原因在于：1）表征过程中，在手动加入样品瞬间，晶体电极频率出现瞬时跳跃，可能会造成表征结果不稳定；2）表征环境的不定噪声、振动影响实验准确测量；3）通过电聚合过程相同条件薄膜制备的CV同步频率F-时间t曲线可知，电极个体差异性也导致了薄膜表征各平行间较大的标准偏差。
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