复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒的初步实验研究

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[摘要] 目的 观察复方叶下珠滴丸体外的抗乙肝病毒作用。 方法 将复方叶下珠滴丸试药稀释后，分别加入HepG2.2.15细胞培养液和HBsAg阳性人血清中，于37℃ 5% CO2培养箱孵育后，收取上清液，采用ELISA法及荧光定量PCR法，分析药物对细胞培养上清液和人血清培养液中HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量的影响。 结果 复方叶下珠滴丸体外对HBsAg、HBeAg和HBV DNA有不同程度的抑制作用，抑制效果最好浓度为120 mg/mL，时间为72 h。 结论 实验结果证明复方叶下珠滴丸具有明显的体外抗乙肝病毒作用。

[关键词] 复方叶下珠滴丸；体外抗病毒；乙肝病毒

[中图分类号] R512.6+2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）02（b）-0015-02

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的感染会导致急慢性乙型肝炎的发生，是引起肝硬化、肝细胞癌的重要因素之一，每年约有50万人死于由HBV感染引起的急性肝炎、肝硬化及肝癌等疾病[1-2]，目前临床尚无治疗乙肝的特效药物。复方叶下珠滴丸是由叶下珠、半边莲、半枝莲、鸡骨草、茵陈、丹参、柴胡等十六味草药经科学提取工艺精制而成的滴丸，具有疏肝解郁，益气健脾，抗乙肝病毒，改善肝功能、调节免疫机能等功效，能防治急慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。本实验采用酶联免疫吸附检测（ELISA）技术和荧光定量（PCR）方法，分析复方叶下珠滴丸对HepG2.2.15细胞培养液及HBsAg阳性人血清培养液中HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量的影响，观察复方叶下珠滴丸体外抗乙肝病毒的作用。

1 仪器与材料

1.1 试药与试剂

试药：采用复方叶下珠滴丸处方中十六味草药以水提醇沉法（加水十倍，煎煮1 h，醇沉浓度为60%）制成的流浸膏（每1 mL含原生药材1 g）为试药。

试剂：HBsAg、HBeAg 诊断试剂盒（新波生物技术公司），靶细胞选择HepG2.2.15细胞（HBV全基因传染的HepG2细胞），HBV DNA荧光定量PCR试剂盒（上海复兴生物技术公司）。

1.2 仪器

EFFICUTA2710免疫分析仪和全自动样本前处理系统，Roche Light Cycler480Ⅱ实时荧光定量PCR系统，37℃ 5% CO2培养箱（Phermo）。

1.3 统计学方法

采用SPSS v19.0统计软件进行处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 方法与结果

2.1 细胞培养

将HepG2.2.15细胞按1×105/mL浓度加入2个24孔培养板中，放入37℃ 5% CO2培养箱培养4 d后换液，将试药稀释，分八组不同浓度药液各滴入4个孔，空白对照组以生理盐水滴入，亦4个孔，加药培养于72 h后各收取1孔细胞上清液， 用 ELISA 测定 HBsAg、HBeAg和PCR检测其HBV DNA含量，并将每组数据与空白对照组进行配对T检验，结果见表1。

根据以上实验，确定复方叶下珠滴丸试药最佳抑制效果浓度为120 mg/mL。为考察其最佳抑制时间，再以120 mg/mL浓度的复方叶下珠滴丸试药，按以上方法培养，加药培养后于24、48、72、96 h后收取1孔细胞上清液再检测其HBsAg、HBeAg和HBV-DNA，48、72、96 h组间数据分别与24 h组进行统计学分析，结果见表2。

2.2 血清培养

将复方叶下珠滴丸试药稀释为120 mg/mL溶液分5组加入HBsAg阳性人血清（HBsAg为2.634 ng/mL，HBeAg为4.799 PEIU/mL，HBV-DNA为650 300 IU/mL），对照组则加入生理盐水，于37℃孵育72 h，取上清液分别用ELISA 测定各组HBsAg、HBeAg和PCR测定各组HBV-DNA，并作统计学分析，结果见表3。

3 讨论

复方叶下珠滴丸是以叶下珠为主药经科学提取工艺精制而成的滴丸，叶下珠为大戟科植物，有清热利尿、平肝明目、消积解毒、止泻之功效，含鞣质类、黄酮类、香豆素类等多种活性成分[3]，对肝损害具有保护作用，能预防原发性肝癌发生[4]，具有抗肝纤维化、抗乙型肝炎病毒的作用[5]，并对肝癌、胃癌多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用[6-7]。辅药中半边莲对肝癌也有明显的抑制作用[8]，半枝莲则可提高机体的抗氧化能力，对肝损伤有保护作用[9]，鸡骨草也有显著的抗乙肝病毒作用[10]。

在HepG2.2.15细胞培养实验中，随着复方叶下珠滴丸试药浓度的增加，对乙肝病毒的抑制作用逐渐增强，呈现一定的剂量依赖性，但其试液浓度为140 mg/mL时对HBsAg、HBeAg抑制作用最强，而其对HBV DNA的抑制作用最强浓度则为120 mg/mL；而其最佳抑制时间的培养试验中，72 h组与96 h组中的HBsAg、HBeAg浓度降低并无差异，HBV DNA抑制作用却与时间呈一定的依赖性；在血清学培养实验结果显示，复方叶下珠滴丸能显著降低HBsAg浓度，具有明显抗HBV的作用。实验结果表明，复方叶下珠滴丸具有明显的抗乙肝病毒作用，今后笔者将做进一步的药效学研究，为临床使用提供实验依据。

[参考文献]

[1] Lim SG，Mohammed R，Yuen MF，et al. Prevention of hepatocellular carcinoma in hepatitis B virus infection [J]. J Gastroenterol Hepatol，2009，24：1352-1357.

[2] Cooke GS，Main J，Thursz MR. Treatment for hepatitis B [J]. BMJ，2010，340：b5429.

[3] 周宇，袁福华，杨连辉，等.叶下珠化学成分的研究进展[J].药学实践杂志，2007（4），206-209.

[4] 张建军，黄育华，晏雪生，等.叶下珠药物血清对人肝癌细胞株的诱导分化作用的实验研究[J].中国中医药科技，2002，9（5）：289-291.

[5] 玉顺子.叶下珠及其制剂药理作用及临床应用研究进展[J].中国药业，2010（7）：87-88.

[6] 李思明，裴晶，李伟，等.叶下珠复方对H22肝癌小鼠的体内抑瘤作用研究[J].当代医学，2011（27）：15.

[7] 黄春林.叶下珠醇提物对人胃癌细胞的抑制作用[J].中国中医急症，2011，（5）：760-761.

[8] 邵金华，张红.半边莲煎剂对小鼠H22肝癌荷瘤细胞系C-erbB-2和P53表达的影响[J].中国临床药学杂志，2010，（6）：372-375.

[9] 赵杰，孙设宗，官守涛，等.半枝莲多糖对四氯化碳致小鼠肝损伤保护作用的研究[J].中国中医药科技，2012，19（1）：39-40.

[10] 韦敏，陈晓白.鸡骨草对HepG2.2.15细胞HBeAg和HBsAg的抑制作用[J].时珍国医国药，2012，（4）：972-973.

（收稿日期：2012-08-23 本文编辑：郝明明）