棉花后代群体筛选方式分析

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转基因植株的筛选鉴定是植物转基因研究的重要环节。目前，转基因棉花筛选鉴定的常用方法为卡那霉素筛选法和PCR分子检测法［1－2］。针对不同试验目的，这两种方法相关报道的文献较多，但都有较强的针对性，在实际转基因棉花育种过程中，这两种方法的应用均存在弊端。卡那霉素筛选法不能反映目的基因的表达效果，其筛选结果缺乏可靠性。PCR分子检测法对试验室要求严格，检测费用昂贵，检测周期长。此外，转基因克隆研究的发展迅速，不断出现新的抗虫基因、抗旱基因、抗病基因［3］，通过外源目的基因表达，而进行生物测定的筛选方法各不相同，过程复杂，筛选缓慢。特别是近年，随着大规模转基因研究的相继开展，传统的筛选方法已无法满足大规模转基因后代的高效筛选，尤其是在转基因杂交育种中，需要在开花前得到准确筛选结果，以便育种操作，传统的筛选方法在效率上尚略显不足。因此，探索一种快速，准确、较为系统的筛选方法，进行大规模转基因棉花后代群体的筛选显得尤为重要。本试验结合我国棉花转基因育种中的两个主流方法［4－5］，以花粉管导入［6］外源基因自交系T1－T3、转基因杂交育种F1种子为材料，探讨田间卡那霉素筛选与PCR分子鉴定相结合，应对大规模转基因棉花后代筛选的可靠性和实用性，为转基因棉花后代的筛选鉴定提供参考。

1材料与方法

1．1材料供试品种为绿色棉陇绿棉3号、白色棉陇棉2号、棕色棉BC05，均由甘肃省农科院作物所棉花研究室选育、提供，具有纤维品质优良、产量稳定等突出性状［7－8］。转基因鉴定的供试材料为：①通过花粉管通道法对陇绿棉3号、BC05导入抗虫基因GNA、抗旱基因GhABF2的T1－T3；②WBK09、20090713－1979分别与陇绿棉3号、BC05、陇棉2号杂交F1（GNA、GhABF2的基因质粒、引物序列由中国农科院生物技术研究所提供；WBK09含Bt抗虫基因，材料和引物序列均由中国农科院生物技术研究所提供；20090713－1979含BADH抗旱基因，材料和引物序列由新疆农业大学农学院提供），花粉管导入T1－T3材料为海南、敦煌两地繁育所得，WBK09、20090713－1979与供试品种杂交F1由海南育种所得。GNA、GhABF2的基因质粒与WBK09、20090713－1979均携带NPTⅡ标记基因（新霉素磷酸转移酶基因），该基因是目前基因工程中被广泛使用的选择标记，它对植物细胞表现毒性的机理是：卡那霉素干扰了细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合成，最终导致植物细胞死亡，而转基因植株抑制了这个过程［9－10］。供试材料种植于甘肃省敦煌市肃州镇隔离试验区。分子鉴定地点为甘肃省农科院生物技术研究所基因工程研究室。

1．2方法

1．2．1卡那霉素浓度梯度试验。设置卡那霉素3．0g•L－1、5．0g•L－1、7．0g•L－1三个处理浓度，在棉花现蕾期，对供试品种顶端倒数第2片真叶用毛笔涂抹药液，各处理50株，以WBK09做对照（经过PCR分子检测，携带NPTⅡ标记基因），3～5d观察统计结果。

1．2．2卡那霉素抗性植株筛选。在卡那霉素浓度梯度试验的基础上，对转基因供试材料进行卡那霉素筛选，对筛选后的阳性植株做标记，以备PCR分子检测。

1．2．3PCR分子检测。剪取阳性植株顶端较嫩叶片，采用改良的CTAB大量提取法［11］提取纯化基因组DNA，针对阳性植株所含不同基因，利用设计好的引物（表1）进行PCR检测。PCR体系所用药剂为Fermentas公司生产，采用引物由Invitrogen公司合成，统计检测结果。

2结果与分析

2．1不同品种敏感性及卡那霉素筛选条件的确定根据田间观察结果，对棉叶与卡那霉素处理反应的表现分为三个等级，Ⅰ级：涂抹叶片正常；Ⅱ级：涂抹叶片有轻微变黄；Ⅲ级：涂抹叶片具有黄色斑点（图1），为了得到可靠的卡那霉素筛选结果，消除棉花叶片自身对卡那霉素具有抗性的试验影响，以Ⅲ级处理结果作为卡那霉素筛选标准。在该筛选标准下，对试验结果进行统计，结果表明：三种浓度的卡那霉素棉叶涂抹，3～5d内，均使陇棉2号、陇绿棉3号、BC05的棉叶百分之百转变为具有黄色斑点的叶片；对照WBK09经过浓度为7．0g•L－1卡那霉素棉叶涂抹，在3～5d内，叶片仍未变化。该结果表明，3．0～7．0g•L－1卡那霉素叶片涂抹，可以明显区分转基因与非转基因植株。此外，参试品种在5．0g•L－1卡那霉素叶片涂抹处理下，百分之百转变为具有黄色斑点叶片，陇棉2号需要3d，BC05需要4d，而陇绿棉3号需要5d；因此，可以认为，陇棉2号棉叶对卡那霉素最为敏感，BC05次之，陇绿棉3号棉叶与卡那霉素反应最为迟缓。在保证准确性的前提下，为了快速得到筛选结果，可以确定陇棉2号的最佳筛选条件为5．0g•L－1卡那霉素叶片涂抹，0～3d观察期；BC05的最佳筛选条件为5．0g•L－1卡那霉素叶片涂抹，0～4d观察期；陇绿棉3号的最佳筛选条件为3．0g•L－1卡那霉素叶片涂抹，0～5d观察期（见表2）。

2．2卡那霉素筛选结果分析在确定卡那霉素筛选最佳条件后，以各品种最佳筛选条件对相关转基因后代进行田间筛选操作，0～5d内，共计筛选出820份叶片未变色的植株，其中，陇棉2号181株，陇绿棉3号324株，BC05315株。陇棉2号、陇绿棉3号、BC05在筛选过程中得到稳定筛选结果的时间分别为第3d，第4d，第5d（表3），该结果表明，针对不同品种确定的最佳筛选条件具有一定的可靠性。由于操作简单，本次试验仅用5d完成21112份转基因棉花后代材料的田间筛选，因此，可以认为，田间卡那霉素筛选可以快速、准确地筛选出具有卡那霉素抗性的转基因植株。

2．3PCR分子检测结果分析对820份阳性植株，进一步进行PCR分子检测，得到具备NPTⅡ标记基因的材料806份，携带目的基因的材料有161份，其中转基因杂交育种F1中，有158份含有目的基因；通过花粉管导入基因的T1－T3材料中，虽然有269份材料验证出NPTⅡ标记基因，但只有3份材料具备目的基因（表4，图2）；经过多次重复，结果一致。该结果表明：卡那霉素阳性植株筛选的准确率为98．3％，卡那霉素筛选携带目的基因的转基因植株准确率为20％；处于连锁状态的标记基因与目的基因，在转基因育种过程中没有完全转化或遗传。

3结论与讨论

本试验通过对陇棉2号、陇绿棉3号、BC05非转基因植株进行卡那霉素敏感试验，以确定田间卡那霉素筛选的最佳条件，在此试验基础上，对其相关转基因后代进行田间卡那霉素初筛，对筛选后的材料进行分子鉴定。试验结果表明，在实际转基因棉花育种中，应对大规模转基因棉花后代筛选鉴定，卡那霉素叶片涂抹与目的基因PCR检测相结合，具有简单、快速、准确的特点，是一种高效的筛选方法，具备一定的实用性。在卡那霉素浓度梯度试验中，不同品种的棉叶对卡那霉素的敏感性不同，与白色棉陇棉2号相比，绿色棉陇绿棉3号，棕色棉BC05的叶片小，蜡质层较厚，该生理性状影响叶片与卡那霉素反应。王彦霞、燕丽萍、李举等［12－14］在卡那霉素筛选研究中，使用的卡那霉素筛选浓度也各不相同。因此，不同品种在不同地区做转基因材料田间筛选，要得到准确的筛选结果，必须进行前期梯度试验。在PCR分子检测试验中，标记基因鉴定结果与目的基因鉴定结果相差甚远，这种情况在通过花粉管导入后代的材料中尤其明显，祝建波［15］在研究过程中也发现类似情况，并推测原因是：在转基因过程中，标记基因与目的基因在核酸酶的影响下，形成不完整片段。由于这种原因一般只导致出现个别异常，在本次试验中，试验群体庞大，不会造成差异如此悬殊的标记基因与目的基因鉴定结果，所以，在本次试验的基础上，推测原因为：处于连锁状态的标记基因和目的基因在转基因过程中存在分离情况。该推测需要进一步试验研究进行论证，但试验结果可以明确，卡那霉素筛选准确率低，目的基因PCR鉴定才是准确的筛选方法。在大规模转基因棉花育种中，快速、准确的筛选尤为重要。尤其在转基因杂交育种过程中，需要在开花前得到准确的筛选结果，以便进行亲本选配及杂交组合的田间操作，此时，如果对转基因育种T0进行卡那霉素快速筛选，缩小范围后，再进行准确的分子鉴定跟踪，可以大规模减少后代群体，提高筛选效率，尽早筛选得到含有目的基因的转基因材料，加快其后代进行遗传稳定性、基因表达量的研究，缩短安全性申报及产业化进程。