乳宁合剂对乳腺癌小鼠癌组织VEGF及MVD表达影响的研究

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摘要：目的观察乳宁合剂对乳腺癌小鼠癌组织血管内皮生长因子（vegf）表达和微血管密度（mvd）的影响。方法建立小鼠乳腺癌移植瘤模型，实验分为乳腺癌模型组、参一胶囊组、乳宁合剂高、中、低剂量组。分组给药21 d后，免疫组化法测定肿瘤组织中的VEGF和MVD。结果与模型组相比，乳宁合剂高、中剂量组及参一胶囊组均可明显降低VEGF和MVD表达（P

关键词：乳宁合剂；乳腺癌；血管内皮生长因子；微血管密度

中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）04-0085-02

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中具有特殊生物W行为和临床病理特征的一种独立类型，占乳腺癌总发病率的10～20.8%[1]。现有研究表明与非TNBC相比，TNBC具有侵袭性高、术后复发转移风险高、疾病进展快、内脏转移风险高等特点[2]，目前尚无明确针对TNBC的治疗标准。

全国第四、第五批老中医药专家学术经验继承工作指导老师、云南省名中医李斯文教授在三阴性乳腺癌的治疗中主张从肾论治，以补肾活血方药为主组成的乳宁合剂即为此而设。本实验通过建立小鼠三阴性乳腺癌模型，采用免疫组化法检测VEGF和MVD在肿瘤组织中的表达情况，探讨乳宁合剂抗三阴性乳腺癌的作用机理。

1材料

1.1实验动物与细胞系4～6周龄雌性BALB/c（nu/nu）小鼠，SPF级，体重18±2 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK（京）2007-0001，饲养于中国科学院昆明动物研究所实验动物中心。人TNBC细胞株MDA-MB-231购自中国科学院昆明动物研究所细胞培养中心。

1.2药物中药乳宁合剂主要由熟地、仙灵脾、菟丝子、枸杞子、丹参、郁金、莪术、八月札、薏苡仁、当归等组成。以上中药饮片均由云南省中医医院中药房提供，由本院制剂室制备，制剂方法：将中药浸泡2 h，常规煎煮3次，合并3次滤液，浓缩药液浓度相当于3.2 g/mL，4℃冰箱保存。参一胶囊（吉林亚泰制药股份有限公司，批号：20140910）。

1.3试剂ZLI一9032浓缩型DAB试剂盒、兔抗鼠CD34单克隆抗体由北京中杉金桥生物技术有限公司生产，批号：60882801。

1.4仪器电子天平JS1603-C：瑞士meittler公司；STPl20脱水机：MICROM公司；AF280―2包埋机：MICROM公司；HM335E切片机：MICROM公司；Nikon e.elipse 80i显微镜：Nikon公司；Carl Zeiss In--sing Systems：CarlZeiss公司；DRP-9052型电热恒温箱：上海森信实验仪器有限公司；BG-270隔水式电热恒温箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

2方法

2.1乳腺癌小鼠模型制备、分组及给药在无菌条件下，取处于对数生长期的TNBC MDA-MB-231细胞，调整细胞密度为 1×107个/mL，以0.2 mL/只的量接种于BALB/C雌性小鼠左侧腋部皮下，待小鼠皮下实体瘤直径长至5 mm时随机分组给药。参一胶囊组用生理盐水配成5 mg/kg混悬液；乳宁合剂高、中、低剂量组分别以生理盐水配成32 g/kg，16 g/kg，8 g/kg的药液；以上各组均以10 mL/kg/只灌胃，每日1次；乳腺癌模型组每日给予等量生理盐水灌胃。以上各组连续给药3周。

2.2观察指标测定

2.2.1瘤重、抑瘤率检测持续灌胃21 d后次日处死小鼠，剥离瘤体，用电子天平称取各组小鼠实体瘤重量（W），计算抑瘤率（I）[3]：I=（对照组W―治疗组W）/对照组W×100%。

2.2.2小鼠瘤组织VEGF表达的测定瘤体取下后经10%甲醛固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，于肿瘤最大切面组织块处做3～5um的连续切片，进行免疫组化染色。切片置于60℃烤箱烘烤2 h；切片脱蜡至水；蒸馏水洗2 min；高压热修复：高压锅内放适量自来水，将修复液倒入烧杯内，将烧杯置于高压锅内煮沸，将切片放入装有修复液的烧杯内，加热至设定压力冒气后持续2 min，自来水冷却；3%H2O2溶液阻断过氧化物酶10 min；PBS洗5 min×3次；滴加一抗，37℃孵育60分钟；PBS洗5 min×3次；滴加二抗，37℃孵育60min；PBS洗5 min×3次；DAB显色；复染、透明封片，镜下观察。

2.2.3小鼠瘤组织MVD计算VEGF免疫组化法染色后，先在低倍镜（×100）下全面观察切片以确定肿瘤内血管密度最高处，高血管密度区多位于肿瘤边缘。在高倍镜（×400）下，以肿瘤内任何一个棕色染色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管，只要结构不相连，其分支结构也作为一个血管计数。记录5个视野内的微血管个数，取其平均数作为该切片MVD值。

2.3统计学方法计量资料以均值±标准差（x±s）表示，采用SPSSl3.0统计软件包统计数据，多组间比较用方差分析，然后用LSD法进行组间两两比较，P

3结果

3.1乳宁合剂对小鼠移植瘤的抑瘤作用结果见表1。

3.2乳宁合剂对荷瘤小鼠肿瘤组织VEGF、MVD的影响结果见表2。

由表2可知，乳宁合剂各剂量组和参一胶囊组的VEGF、MVD表达均小于模型组，其中乳宁合剂高、中剂量组VEGF、MVD与模型组相比有统计学意义（P

4论

Hanahan等[4]于1996年提出血管生成的开关平衡假说，认为血管生成受血管生成促进因子和血管生成抑制因子的共同调控。血管内皮生长因子（VEGF）是目前研究最广泛、作用最强的血管生成正调控因子。它主要通过自分泌或旁分泌与内皮细胞上的相应受体（VEGFR）结合，促进血管内皮细胞分化、增殖、迁移，增加毛细血管通透性，刺激肿瘤新生血管生成[5～6]。微血管密度（MVD）直接量化反映肿瘤血管生成的程度，不仅与肿瘤细胞的营养和供氧有关，而且反映了肿瘤的侵润和转移能力[7]。由于三阴性乳腺癌较高的侵袭、转移特性，抗肿瘤血管生成对三阴性乳腺癌的治疗具有重要意义。故本文选择VEGF、MVD为观察指标，探讨了不同剂量的乳宁合剂对三阴性乳腺癌组织血管生成的影响。

在多年的肿瘤防治工作中，云南省名中医李斯文教授体会到肝脾肾、冲任二脉功能失调与乳腺癌的发病密不可分，其中尤以肾居于核心地位。李斯文教授认为，肾水亏虚，则肝木失于涵养，其调达之性不能伸展，易于怫郁，气滞日久，木壅侮土，脾胃受损，脾失健运，痰湿内聚，气机不畅，血滞为瘀，痰瘀胶结，循厥阴之脉聚于而成Y瘕。肾主生殖，为冲任之本，肾虚则肝脾、冲任易病，肾强则肝脾、冲任易调。因此，在治疗中坚持“肾为核心”、“益肾为先”的治疗原则，并贯彻病程治疗始终。李教授还认为肾元亏虚是乳腺癌发病的始动因素，由其导致的瘀血阻滞在疾病的发生发展过程中占有重要地位。以补肾为基础的补肾活血法是乳腺癌治疗的重要法则，凝聚李斯文教授多年临床经验的乳宁合剂即为此而设。

实验研究结果表明，与模型组比较，乳宁合剂高、中剂量组和参一胶囊组均能够明显降低移植瘤组织VEGF表达和MVD（P

参考文献：

[1]Amirikia KC，Mills P，Bush J，et al.Higher population-based incidence rates of triple-negative breast cancer among young African Amerian women：implication for breast cancer screening recommendations[J].Cancer，2011，117（2）：2747-2753.

[2]顾军，于泽平，李宁.三阴性乳腺癌的研究进展[J].医学研究生学报，2010，23（1）：105-106.

[3]Lud GD.Baylin SB.Successful Treatment with DL-α-difluo-romethyl-ornithine in established Human small cell variang luang carcinmoma impl-ants in athymic mice[J].Cancer Res，1983，43：4239-4243.

[4]Hanahan D，Folkman J.Patterms and emerging mechanisns of the angio-genic seich during tumorigegenesis[J].Cell，1996，86（3）：353-364.

[5]Frelin C，Ladoux A，D，angelo G.Vascular endothelial growth factors and angiogenesis[J].Ann Endothelial Paris.2000，61（1）：70-74.

[6]Gerwins P.Skoldenberg E..Claesson Welsh L.Function of fibroblaste growth factors and vascular endothelial growth factors and their receptors in angiogenesis[J].Crit Rev Oncol Hematol，2000，34（3）：185-194.

[7]Zolota V，Gerokosta a，Melachrinou M，et al.Microvessel density，proliferating activity，P53 and bcl-2 expression in situ ductal carcinoma of the breast[J].Pediatrics，1999，103：1145-1149.