慢性束缚应激小鼠海马应激性病理效应
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作者：杨宁波 吴爱勤 王传升 李洁
【关键词】 束缚应激；海马；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶
【摘要】 目的 观察慢性束缚应激下小鼠海马神经元数目的改变及天冬氨酸特异性半光氨酸蛋白酶3的活性，探讨应激对海马的损害作用及途径。方法 将16只小鼠随机分为对照组和应激组各8只，采用50ml离心管建立慢性束缚应激模型，每晚束缚8min。14d后处死，取小鼠海马常规固定制HE片、免疫组化天冬氨酸特异性半光氨酸蛋白酶3片，在显微镜下进行细胞记数并显微拍照。结果 慢性束缚应激组小鼠海马数目较对照组减少（P<0.05），同时天冬氨酸特异性半光氨酸蛋白酶3阳性细胞率增加(P<0.05)；镜下神经元发生空泡变性，存在典型凋亡细胞。结论 慢性束缚应激海马神经元凋亡蛋白天冬氨酸特异性半光氨酸蛋白酶3活性增加，天冬氨酸特异性半光氨酸蛋白酶3可能参与了应激状态下海马的细胞凋亡。
【关键词】 束缚应激；海马；天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3；病理形态学
Stressful pathological effects of hippocamal in chronic restraint stress mice
【Abstract】 Objective To observe changes of hippocamal neurons and activities of Caspase3 in the hippocampus of chronic restraint stress mice and explore the injuring actions and ways of stress to hippocampus. Methods 16 mice were randomly divided into control and stressful group(both n=8),RST devices were constructed with 50ml polypropylene conical tubes, restrain stress was imposed for 8 minutes per night. After Fourteen days mice were killed and brains were taken. The paraffin section for the He and immunohistochemistry Caspase3 were routinely made, counts of positive cell and photomicrographs taken under microscope. Results Decrease of hippocamal neurons were more marked in the stress than in the control group(P<0.05) and rate of positive cell of Caspase3 increased more significantly(P<0.05); Neurons developed vacuolar degeneration and had dead cells. Conclusion Activity of hippocamal Caspase3 increased and Caspase3 might play a role in the death of hippocamal neurons under stress.
【Keywords】 Restraint stress; hippocampus ;Caspase3; pathomorphism.
慢性持久的不良刺激对大脑可产生病理生理损害。流行病学资料显示,慢性应激与很多精神障碍如复发性抑郁症和创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder,PTSD)的发病密切相关［1,2］。国外有资料表明,慢性应激可以导致动物海马CA1和CA3区锥体细胞形态结构受损,并认为这可能与随后发生的精神障碍有关。新近的研究发现［3］ ,天冬氨酸特异性半光氨酸蛋白酶3(Caspase3)参与了神经退行性疾病的发生。本研究通过建立慢性束缚应激模型，观察海马脑组织的形态学改变，并半定量检测海马Caspase3活性，探讨慢性应激对海马的病理损害。
1 材料与方法
1.1 试剂器材 兔抗小鼠Caspase3抗，购于武汉博士德公司；ULTRASENSITIVETMSP超敏试剂盒，购于福建迈新生物技术开发公司；75%酒精，4%多聚甲醛，DAB显色液（3二氨基苯联胺显色液），50ml离心管（打孔3mm，通风良好），奥林巴斯显微摄像显微镜（日本），COINC光学显微镜（重庆）等。
1.2 分组处理
1.2.1 昆明小白鼠，周龄4～6w,体重19±2g，由苏州大学试验动物中心提供。将实验小鼠随机分为对照组(NC)和应激组(SS)，每组8只，实验前对照组和应激组在相同的环境下适应1w，温度20℃，湿度60%。笼舍为标准洁净的啮齿动物笼，垫料为木屑，每5d换1次垫料。
1.2.2 操作流程 依次将小鼠放入50ml离心管中，可前后排列［4］。8h后将动物放出，恢复自由,供食物和水，全部动物在应激时间禁食禁水，应激5次・w-1，共2w。
1.3 标本制作 在应激10次后，摘眼球放血处死小鼠，取大脑，于4%多聚甲醛中固定，海马取视交叉至体组织［5］，行石蜡切片，制作HE及免疫组化染色，切片厚度8um。高倍镜下(400x)对海马CA1、CA2、CA3和DG区锥体细胞进行双盲法计数(CA1、CA2区选取细胞数较为恒定的中段)。每张切片取连续的两个视野,并保证锥体细胞层的弧度弦置于目镜的直径上,取两视野的平均值为该切片锥体细胞数,5张切片的平均值为该样本的锥体细胞数［6］。脑片室温下晾干,0.01MPBS冲洗,加入Caspase3单克隆抗体,4℃过夜,0.01MPBS冲洗,加生物素标记的二抗工作液,37℃1h,0.01mol・LPBS冲洗,加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液,37℃1h,0.01mol・LPBS冲洗,DAB显色。用图像分析仪,对免疫组化结果进行光密度扫描,计算平均光密度值。
1.4 统计方法 所有数据采用均值±标准差(±s)表示。两组海马细胞数比较采用t检验,应激后海马神经细胞Caspase3表达比较采用方差分析。
2 结果
2.1 应激小鼠行为观察 小鼠在束缚后起初几日表现为梳毛增多，敏感、烦躁,易激惹,进食减少，同伴之间常有厮打。第二个束缚周期开始后，小鼠表现为逐渐少动，喜欢蜷缩在一起，毛发蓬松,缺乏光泽，顺从，激惹呈回避反应。
2.2 应激后小鼠肾上腺皮质组织学变化,见图1。
图1 正常肾上腺HE200 应激肾上腺HE200 （略）
2.2.1 NC组 皮质球状带结构:细胞排列紧密,呈不规则索状,呈圆形或椭圆形；核大且位于中央,染色深。皮质束状带结构:细胞成放射状,细胞较球状带大,呈多边形和圆形；胞核淡染。皮质网状带:细胞呈多边形,细胞索互相吻合形成网状,索间有血窦；胞核小,间质多,核大。
2.2.2 SS组 肾上腺皮质球状带:细胞排列不规则,呈团块状和索状,细胞呈圆形或椭圆形；核小,位于中央,染色深。皮质束状带结构:细胞基本失去平行或呈网状排列,细胞呈圆形或椭圆形；细胞索之间有血窦和少量结缔组织；胞核大且染色浅；胞质含多量的脂质颗粒,有的细胞有脱颗粒现象。肾上腺网状带:细胞呈多边形,较小；细胞索相互吻合成网状结构；胞核小,染色深。
2.3 应激对海马的影响
2.3.1 光镜HE观察与神经元记数 NC组小鼠海马各区神经元均成规则构筑样排列,SS组海马各区神经元有不同程度的丢失，CA1、A2区最明显，CA3区次之，DG丢失最少。可见神经元脱失,部分核固缩深染,裂解成碎片状,或细胞变性、溶解(图2)。两组海马各区神经元记数比较见表1。
表1 两组海马各区神经元记数比较（略）
注：与NC比较P＜0.05；与NC比较*P＜0.01
表1显示,两组海马CA1、CA2区神经元记数比较差异有极显著性（P＜0.01）,在CA3及DG区有显著性差异（P＜0.05）。
2.3.2 应激后小鼠海马神经细胞Caspase3表达 在正常小鼠海马内有基础表达,但染色强度弱,而施加应激10次,Caspase3蛋白表达就明显增强,应激组各海马分区阳性细胞数目均增加，CA1、CA2阳性细胞表达最多,有显著性差异（P＜0.05）,CA3次之,仍有差异性（P＜0.05）；DG区阳性细胞最少,但与各自对照比较有差异性（图3,图4、）。