好氧反硝化细菌的筛选

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摘要：采集江安河及府河淤泥样本，采用BTB培养基与N-（1-萘基）-乙二胺光度法筛选出20株具有反硝化能力的好氧菌株。选取其中5株反硝化能力较强的DM1、DM2、DM3、DM4和DM5菌株，进行NO3--N去除率测定，其48 h NO3--N去除率均达到了30%以上。其中DM1、DM2、DM3和DM5菌株氮去除率依次为43.9%、47.6%、47.9%和51.3%。对DM5菌株进行生长曲线测定，进行pH值和温度对反硝化速率影响测定，试验结果表明在pH 7.0～7.4，温度20～30 ℃时，DM5菌株反硝化效果较好。

关键词： 好氧；反硝化细菌；分离；反硝化效率

中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）05-1053-04

Screening of Aerobic Denitrifying Bacteria

HE Wei，ZHANG Yue-xiao，LI Yong-hong

（College of Chemical Engineering， Sichuan University， Chengdu 610225， China）

Abstract： By using BTB medium and N-（1-naphthyl）-ethylenediamine photometry， twenty aerobic strains that were capable of denitrification were isolated from the silt samples of JIANG AN river and FU river. Being more capable， five individuals numbered as DM1， DM2， DM3， DM4 and DM5 of the above strains were selected to determine the nitrate removal rate. The results of determination of aerobic denitrifying activity showed that the nitrate removal rate of all the five strains was more than 30%. And the nitrate removal rate of DM1，DM2，DM3 and DM5 was 43.9%，47.6%，47.9% and 51.3% respectively. The determination of the DM5 growth curve as well as the influence of the pH value and temperature on denitrification rates showed that when the pH value range for DM5 was 7.0～7.4 and the temperature was between 20 ℃ and 30 ℃， the efficience of nitrogen removal was better.

Key words： aerobic； denitrifying bacteria； screening； nitrate removal rate

工业生产中未经处理的含氮废水的排放造成了我国河流、湖泊及海洋氮含量普遍增高，进一步导致湖泊富营养化、海洋赤潮等现象，极大地危害到水生物的生存繁衍以及人类自身的健康。此外，农用氮肥的使用加大了地下水硝酸盐污染程度，硝酸盐可在一定条件下转化为亚硝酸盐，而亚硝酸盐极易致癌，危害人们生命。我国地下水合格率仅为30%[1]，因此，探究高效经济的脱氮工艺迫在眉睫。

传统的物化脱氮法包括吹脱法[2]、MAP沉淀法、膜法、折点加氯法和离子交换法，主要用于高浓度含氮废水处理，而对于低浓度含氮废水而言其成本相对过高，而运用新型生物脱氮法进行低浓度废水处理则优势明显。现阶段生物脱氮法主要包括活性污泥法[3]、固定化生物脱氮[4]以及微生物制剂[5]等，其理论技术都趋于成熟，然而其前提条件是找到一种反硝化效率较强的菌株。

本研究以江安河和府河淤泥为基础，以硝酸钾为惟一氮源，以梯度划线法和BTB平板筛选等方法相结合进行好氧反硝化细菌的筛选，得到反硝化效率较高的菌株，并对所得菌株反硝化能力进行pH值以及温度影响的评估，以得到菌株最适的反硝化条件，为生物脱氮提供新的菌种选择依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 从江安河和府河采取污泥样本进行菌株筛选以及反硝化性能的研究。

1.1.2 培养基及试剂 LB液体培养基（1 L）：KNO3 1.00 g、KH2PO4 1.00 g、FeCl2・6H2O 0.05 g、CaCl2・7H2O 0.02 g、MgSO4・7H2O 1.20 g、琥珀酸钠8.60 g，1×105 Pa灭菌20 min；BTB初筛培养基[6] （1L）：琼脂20.00 g、KNO3 1.00 g、KH2PO4 1.00 g、FeCl2・6H2O 0.50 g、CaCl2・7H2O 0.20 g、MgSO4・7H2O 1.20 g、琥珀酸钠8.50 g、溴百里酚蓝（BTB）（1%乙醇溶液）1 mL，用1 mol/L的NaOH调节pH至7.0～7.3，1×105 Pa灭菌20 min；DM反硝化培养基（1 L）：KNO3 0.72 g、KH2PO4 1.00 g、MgSO4・7H2O 1.00 g、琥珀酸钠4.30 g，1×105 Pa灭菌20 min；盐酸N-（1-萘基）-乙二胺光度法[7]所用试剂：盐酸溶液和对氨基苯磺酸溶液；紫外分光光度法[8]所用试剂：盐酸溶液和氨基磺酸铵溶液。

1.2 方法

1.2.1 细菌富集 取适量江安河和府河淤泥分别加入盛有50 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中，在温度为30 ℃、摇床转速为180 r/min的条件下培养48 h。

1.2.2 细菌初筛 吸取适量富集后的培养液，分别进行104、105、106及107倍稀释。用移液器分别吸取稀释后的培养液0.1 mL均匀涂布于BTB固体培养基上，在温度为30 ℃的条件下培养48 h。由于反硝化过程中NO3-还原会使培养基的pH值升高，试验中所用的选择性培养基（BTB初筛培养基）所含的产碱指示剂溴百里酚蓝能够准确地指示这一变化，而显现出蓝色，因此选取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落作为初筛菌株。

1.2.3 细菌复筛 将上述初筛得到的菌株，用接种环在无菌条件下接种到盛有50 mL DM反硝化液体培养基的250 mL的三角瓶中，在温度为30 ℃、摇床速率为180 r/min的条件下培养48 h。再将培养后的菌株接种到新鲜的DM反硝化液体培养基中，在同样条件下培养48 h。重复上述步骤4次，可基本得到纯化菌株。利用盐酸N-（1-萘基）-乙二胺光度法检测培养液中是否有NO2-产生。选取变红的细菌培养液进行NO3-含量测定，得到能使NO3-明显降低的菌株作为复筛菌株。将复筛后得到的菌株接种于DM反硝化斜面，保存于4 ℃冰箱中。

1.2.4 好氧反硝化细菌反硝化速率测定 菌悬液的制备：从斜面中，用接种环接一环细菌于装有20 mL DM反硝化培养基的100 mL三角瓶中，在温度为25 ℃、摇床转速为160 r/min条件下培养16 h后，保存于4 ℃冰箱。在盛有20 mL新鲜DM培养基的100 mL三角瓶中接入0.5 mL上述菌悬液，在温度为25 ℃、摇床转速为160 r/min条件下培养。以未接种菌株的DM液体培养基作为对照，每隔24 h测定NO3-浓度，连续检测48 h。检测方法为紫外分光光度法，所用仪器为北京普析通用仪器有限责任公司生产的TU-1810紫外分光光度计。以上试验均设置2个平行样，最终数据取平均值。

1.2.5 好氧反硝化细菌生长曲线测定 移取1 mL细菌菌悬液于盛有100 mL新鲜DM培养基的500 mL三角瓶中，在温度为25 ℃，摇床转速为160 r/min的条件下培养。以未接种菌株的DM培养基作为对照，培养6 h后，每隔4 h取一次样。用TU-1810紫外分光光度计于波长540 nm处测定其光密度值。利用细菌浓度与光密度值成正比的关系，绘制光密度值和时间的关系曲线，即为细菌生长曲线。

1.2.6 pH对好氧反硝化细菌反硝化效率的影响测定 分别移取0.5 mL细菌菌悬液接种于pH为3.0、5.0、7.0、8.0、9.0及11.0盛有50 mL新鲜DM培养基的250 mL三角瓶中，在温度为25 ℃、摇床速率为160 r/min的条件下振荡培养48 h后，用紫外分光光度法检测培养液中NO3--N浓度。

1.2.7 温度对好氧反硝化细菌反硝化效率的影响测定 将细菌菌悬液以0.5 mL的含量接种于盛有50 mL新鲜DM反硝化培养基的的250 mL三角瓶中，分别在温度为15、20、25、30及45 ℃条件下培养。48 h后，用紫外分光光度法检测培养液中NO3--N浓度。

2 结果与讨论

2.1 好氧反硝化细菌筛选结果

从江安河和府河淤泥中初筛得到能使BTB培养基变蓝的菌株30株，且均是从稀释106倍的涂布平板得到，其中江安河淤泥中筛选得到菌株18株，府河淤泥中筛选得到菌株12株。为保证菌株的单一性，之后对上述试验得到的菌株进行了5次DM液体培养基纯化。复筛时，培养液中分别滴加对氨基苯磺酸溶液和盐酸N-（1-萘基）-乙二胺溶液，培养液能变红的细菌菌株共20株。其原理在于反硝化过程中会生成亚硝酸盐，而亚硝酸盐与对氨基苯磺酸生成重氮盐，再与N-（1-萘基）-乙二胺偶联生成红色染料。因此这也证明了这20株菌在好氧情况下能够进行反硝化过程的第一步，确实是我们需要筛选得到的细菌。为了进一步明确菌株的反硝化作用效果，试验利用紫外分光光度法测量NO3--N浓度，得到能使其明显降低的细菌菌株16株，筛选得到降解硝酸盐能力较强的细菌菌株5株，编号分别为DM1、DM2、DM3、DM4及DM5。

试验发现反硝化能力较强的5株好氧反硝化细菌均筛选自江安河的淤泥中，并且在DM反硝化液体培养基中培养时发现培养液均会变为绿色粘稠状，但颜色程度有所不同（图1），上述结果与李永勇等[9]的研究结果相似。

2.2 好氧反硝化细菌DM5的形态特征

将筛选得到的DM5菌株在平板上划线，于25 ℃的恒温培养箱中培养48 h，其结果如图2所示，菌株呈乳黄色，光滑湿润，易挑取。对DM5菌株进行电镜观察，发现DM5菌株大小约为0.3～0.5 μm×0.8～0.9 μm（图3）。进一步对DM5菌株进行生理生化试验，初步鉴定其为铜绿假单胞菌属（P. Aeruginosa）。

2.3 好氧反硝化细菌的反硝化效率

利用紫外分光光度法，首先绘制NO3-标准曲线（图4），试验以最终筛选的5株细菌为研究对象，进行NO3-去除效率的测定，得到其48 h后的反硝化结果（图5）。由图5可知，其中DM5菌株反硝化效率最高，其NO3-的去除率为51.3%，DM1、DM2及DM3的NO3-去除率均在40%以上。

在试验具体操作过程中，由于紫外分光光度法只适合于低浓度的NO3-含量的检测，因此在进行好氧反硝化细菌培养液的NO3-检测时，本试验将培养液上清液进行了50倍稀释。此外由于试验过程中细菌培养液均有不同程度的绿色，会极大地影响硝酸盐氮含量检测的准确性，因此本试验进行了脱色，并且由于传统的氢氧化铝悬浮液脱色法试剂难以配制，试验改用氢氧化锌法脱色，取得了较好效果。由于是好氧反硝化细菌，为了增加溶解氧，试验过程中采用4层纱布封口，并以速率为160 r/min进行摇床培养，提高了氧传递效率，充分满足了好氧条件。试验证明所筛选菌株在48 h内即可去除大部分NO3-，从而具有较高脱氮效率。将此类菌株应用于废水处理过程中，在通过缩短工作周期提高脱氮效率方面有很大的优势和实际应用价值。

2.4 好氧反硝化细菌DM5的生长曲线

由于细菌浓度与细菌培养液的OD值成正比，试验通过测定培养液在540 nm处的OD值绘制DM5菌株的生长曲线（图6）。细菌生长周期分为延迟期、对数生长期、稳定期以及衰亡期，由图6可知，DM5接种后的对数生长期从16 h开始，从25 h开始进入稳定期，从40 h开始进入衰亡期。由黄运红等[10]对反硝化作用主要发生时间的分析知，反硝化作用时间主要集中在对数生长期，DM5在16～25 h期间即可从很大程度上发挥反硝化作用。

2.5 pH对好氧反硝化细菌DM5反硝化效率的影响

细菌生长代谢均有最适的pH，低于或者高于此值，其代谢活动便会受到抑制。试验以DM5菌株为研究对象，在不同pH值、相同温度以及相同摇床速率的条件下探究pH对其反硝化效率的影响。由结果（图7）可知，当pH在7.0时，NO3--N浓度降低最多，当pH为弱碱性时反硝化效率较pH呈酸性时要高，其结果与黄廷林等[11]的研究结果相似。因此在实际应用中应避免在酸性及强碱性条件下处理含氮废水，以免细菌不能发挥其应有的作用。

2.6 温度对好氧反硝化细菌DM5反硝化效率的影响

温度的升高会提高细菌内部酶活性，从而提高细菌代谢速率，而当温度高于某一值时，酶活性反而会受到抑制甚至失活。试验将DM5菌株置于不同温度下培养，检测培养温度对DM5菌株反硝化效率的影响。由结果（图8）可知，当温度为20～30 ℃时，DM5菌株反硝化效率较高，NO3--N的去除率均在40%以上，表明所筛选的菌株具有较宽的适宜温度范围；而当温度不在此范围内时，NO3--N去除率明显降低。由于是在恒温培养箱中进行培养，DM5菌株的反硝化效率与在相同温度下的摇床中培养相同时间的反硝化效率相比稍有降低，这也进一步验证了该细菌的好氧性。

3 结论

本研究以硝酸钾为惟一氮源，琥珀酸钠为惟一碳源，利用稀释法以及BTB筛选培养基，从江安河中筛选得到去氮能力较强的5株菌株，编号为DM1、DM2、DM3、DM4及DM5。其中DM4菌株脱氮效率为30%，DM1、DM2以及DM3菌株脱氮效率均达到40%以上，DM5菌株达到50%以上。整个试验过程均在好氧情况下进行，筛选得到的细菌均是好氧菌株，与传统的厌氧或微氧脱氮相比，好氧脱氮时间更短，效率更高，更易进行工业化。

通过对DM5菌株的形态以及生理生化试验，初步判定其为铜绿假单胞菌属。对DM5菌株脱氮效率进行pH及温度影响研究，结果发现当温度为20～30 ℃、pH 7.0时，其脱氮效率较高。此外，DM5菌株在微碱性环境下比在酸性条件下脱氮效率要高。

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