HPLC法测定熊胆汁中牛磺熊去氧胆酸含量的研究
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摘要：目的建立熊胆汁中牛磺熊去氧胆酸含量的hplc测定方法。方法用甲醇前处理熊胆汁；以十八烷基键合硅胶为填料；甲醇-磷酸二氢钠溶液（0.03 mol/L）（68：32）为流动相，并用磷酸调节pH值为4.4；柱温40℃；流速1.0 mL/min；进检测波长为210 nm。结果牛磺熊去氧胆酸进样浓度在0.1045 mg/mL～1.045 mg/mL之间呈良好的线性关系，r=0.9999，回收率在98%～102%之间，回收率RSD
关键词：熊胆汁；HPLC法；牛磺熊去氧胆酸；含量测定
中图分类号：284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）10-0078-03
Study on Taurocholate Ursodeoxycholic Acid Content in Bear Bile by HPLC
LI Jia-quan， ZHENG Kun-fang
（Dali Ruipin Junge Pharmaceutical Co.， Ltd.， Dali 671099， Yunnan）
【Abstract】Objective： To establish a HPLC method to determine taurocholate ursodeoxycholic acid content in bear bile. Methods： Bear bile was pre-treated with methanol. Octadecyl bonded silica was taken as a filler， methanol-sodium dihydrogen phosphate solution （0.03 mol/L） （68：32） as mobile phase， and phosphoric acid was used to adjust to pH 4.4. The column temperature was 40℃， with 1.0 mL/min of flow rate， 210 nm of detection wavelength. Results： The sample concentration of taurocholate ursodeoxycholic acid showed a good linear relationship between 0.1045 mg/mL and 1.045 mg/mL， r=0.9999， with the recovery rate between 98% to 102% and recovery rate RSD
【Key words】bear bile， HPLC method， taurocholate ursodeoxycholic acid， determination
熊科动物黑熊经胆囊手术引流而得熊胆汁经干燥制成的熊胆粉，已收载于1989年试行、1996年转为国家正式实行的药品标准[1]，并收载于2015年版《中国药典》附录，作为天然熊胆的替代品入药。牛磺熊去氧胆酸（TCDCA）是熊胆粉主要有效和特有成分，故熊胆粉药品标准中规定TUDCA的含量不得低于23%。但熊胆粉药品标准中未对其原料熊胆汁中TUDCA含量的测定方法作出规定。而熊胆汁和熊胆粉中TUDCA含量的测定方法有一定的差异。熊胆汁原料关乎到所制成熊胆粉的质量，对熊胆汁质量的分析和控制是十分重要的，而其TUDCA含量的测定方法没有报道。本文建立熊胆汁中牛磺熊去氧胆酸含量的HPLC测定方法。方法准确、简便、快速，为熊胆汁的检测及监控提供技术依据和支持。
1仪器与试药
LC98Ⅰ型、LC99Ⅱ型高效液相色谱仪（北京温分分析技术有限公司）、7725Ⅰ型手动进样阀、双通道色谱软件工作站（浙大智达）、UV98I可变波长紫外检测器、C18 5μShodex ID4.6×250mm色谱柱（原装进口）、BCD-176SQMK型美的电冰箱（合肥美的电冰箱有限公司）、SK3300H型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）、微孔滤膜（上海津腾）、色谱甲醇（fisher）、牛磺熊去氧胆酸钠（中国食品药品检定研究院，110816-201208，含量91.7%，牛磺熊去氧胆酸换算因子为0.9578）、分析纯磷酸二氢钠（国药）、分析纯甲醇（国药）、熊胆汁（云南大理瑞品金阁药业有限公司）。
2方法与结果
2.1色谱条件 以十八烷基键合硅胶为填料；甲醇-磷酸二氢钠溶液（0.03 mol/L）（68：32）为流动相，并用磷酸调节pH值为4.4，柱温40℃，流速1.0 mL/min，进样量5 μL，检测波长为210 nm。理论板数按牛磺熊去氧胆酸峰计算不低于2500。在上述条件下，TUDCA与样品中其它成分均能完全分离，分离度大于1.5。对照品与样品图谱见图1A、B。
图1对照品（A）和样品（B）色谱图
2.2样品制备 取新鲜熊胆汁，过120目标准筛，精密量取续滤液0.5 mL置50 mL量瓶中。第一份加甲醇稀释至刻度，摇匀；第二份加乙醇，稀释至刻度，摇匀。取上述溶液，经0.45μm微孔滤膜法过滤后，进样5μL测定，图谱见图2―A、B。
图2乙醇为稀释剂对照品（A）和甲醇为稀释剂对照品（B）色谱图
通过实验结果显示，利用乙醇作为稀释剂存在拖尾，n4500，故选择甲醇作为稀释剂。
2.3对照品溶液制备取牛磺熊去氧胆酸钠对照品适量，精密称定，加甲醇使溶解并定量稀释制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。
2.4供试品制备取熊胆汁不少于25 mL，过120目标准筛，精密量取续滤液1 mL置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.5线性关系考察精密称取牛磺熊去氧胆酸钠对照品28.5 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀。再分别精密吸取上述对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0 mL置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀得系列浓度对照品溶液。取系列浓度对照品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，按上述方法测定。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程为：
A=281822.207.C-1614.773r=0.9999
结果表明：TUDCA进样浓度在0.1045 mg/mL～1.045 mg/mL之间呈良好的线性关系。
2.6准确度考察取新鲜熊胆汁，照供试品制备方法制备并测定样品中牛磺熊去氧胆酸的含量，作为已知浓度的供试品。精密量取已知浓度的供试品溶液0.5 mL置50 mL量瓶中，分别制作3组，每组3份，第1组每份精密加入对照品溶液（精密称取牛磺熊去氧胆酸钠对照品284.6 mg，置250 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀。）10.00 mL；第2组每份精密加对照品溶液15.00 mL；第3组每份精密加入对照品溶液20.00 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取5 μL注入液相色谱仪测定，测得供试品中TUDCA的含量为45.22 mg/mL。回收率结果见下表。
2.7.1重复性取新鲜熊胆汁照供试品制备方法制备6份，进样检测，测定结果TUDCA的含量分别为45.88、46.01、45.82、45.20、45.94、45.92 mg/mL。平均值为45.8 mg/mL，测定值的RSD为0.59%。结果表明，该方法重复性良好。
2.7.2中间精密度取同一均质熊胆汁，由两个分析员分别测定，每人测定6份，TUDCA的含量结果如下。
2.8专属性考察按照供试品制备方法对空白溶液（甲醇）进行处理作为空白组，照上述方法分别测定对照品组、熊胆汁供试品组与空白溶液组，检测结果显示，在该方法下，在供试品主峰保留时间±1.0 min内无干扰峰。结果表明，该方法专属性良好。图谱见图3―A、B、C。
2.9耐用性实验
2.9.1流动相比例变化±5%照供试品制备方法制备供试品，流动相比例按甲醇：磷酸二氢钠溶液（0.03mol/L）比例变化为：63：37、68：32、73：27分别进行检测。检测结果显示在不同比例下，主峰保留时间分别为13.9～14.0、8.2～8.3、5.9～6.0 min之间。n均大于4000，R均大于1.5。同一供试品TUDCA的含量测定结果分别为43.4、43.0、43.6 mg/mL，三者RSD为0.69%。结果表明，该方法流动相比例耐用性良好。
2.9.2流动相pH值变化±0.2照供试品制备方法制备供试品，流动相用磷酸调节PH值分别为4.2、4.4、4.6进行检测。检测结果显示在不同PH值下，主峰保留时间分别为9.2～9.3、9.5～9.7、9.3～9.5 min之间。n均大于4000，R均大于1.5。同一供试品TUDCA的含量测定结果分别为39.3、39.1、40.0 mg/mL，三者RSD为1.20%。结果表明，该方法流动相PH值耐用性良好。
2.9.3柱温变化±5℃照供试品制备方法制备供试品，在柱温35℃、40℃、45℃下分别测定。检测结果显示在不同柱温下，主峰保留时间分别为10.2～10.3、9.7～9.9、8.4～8.6 min之间。n均大于4000，R均大于1.5。同一供试品TUDCA的含量测定结果分别为45.4、45.6、46.1 mg/mL，三者RSD为0.79%。结果表明，该方法柱温耐用性良好。
2.9.4流速相对值变化±20%照供试品制备方法制备供试品，，在流速为0.8 mL/min、1.0 mL/min 与1.2 mL/min下分别测定。检测结果显示在不同流速下，主峰保留时间分别为11.2～11.4、9.9～10.1、7.8～7.9 min之间。n均大于4000，R均大于1.5。同一供试品TUDCA的含量测定结果分别为44.4、45.0、43.8 mg/mL，三者RSD为1.35%。结果表明，该方法流速耐用性良好。
2.10样品检测根据上述方法，对连续10天内产出的10批次熊胆汁TUDCA的含量进行了检测，其结果如下。
3讨论
3.1样品处理方式的选择本项研究中，熊胆汁样品分别用甲醇和乙醇进行处理。经对比实验，得到用甲醇处理优于乙醇处理的实验结果。熊胆汁样品处理没有明确的方法，有的文献认为需用某些蛋白沉淀剂处理。本项研究用甲醇处理并获得较好的结果，操作方便快速，简化了样品前处理过程，降低了检测成本，又提高了检测效率。
3.2流动相组分比例的选择流动相采用甲醇-磷酸二氢钠溶液（0.03 mol/L）的比例为68：32，试验结果TUDCA与样品中其它成分均能完全分离，分离度大于1.5，主峰保留时间适中，表明流动相的这一组分比例可用于熊胆汁样品中TUDCA的含量测定。这一组分比例与熊胆粉检测流动相组分的比例是有一定差异的，比例差异的原因可能与熊胆汁未经过热处理而熊胆粉受过热烘干有关。
参考文献：
[1]卫生部药品标准新药转正标准，熊胆粉，第十一册，1996，WS3-09（B-09）-96（Z）.