小黑杨的蛋白功能释解
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1材料与方法
将从温室中取材的同一无性系小黑杨(Populussimonii×P．nigra)枝条进行水培，于人工气候室中培养，昼/夜温度为26℃/22℃，光照16h/d，光照强度175μmol/(m2•s)，相对湿度约75%。生长40d左右，长出新的根和叶片，将其分成两组，一组作为对照于正常条件下培养，另一组用200mmol/LNaCl进行胁迫处理，分别在胁迫开始时(第0天)和胁迫后的第1、2、4、6、8天中取小黑杨的根、茎、叶，每组重复3次，用蒸馏水清洗，拭干后置于液氮中，于－70℃中保存备用。烟草品种为SR－1(Nicotianataba-cumL．cv．PetitHavanaSR－1)。用SDS法［14］分别提取小黑杨根、茎、叶中的RNA，用SYBRPremixExTaq试剂盒(购于大连宝生物工程有限公司)进行实时定量PCR(Real－timePCR)［15，16］。以胁迫后第2天的小黑杨叶片RNA为模板，根据PsnRZF基因的序列信息(GW672596)设计引物进行5’/3’克隆，方法见5’/3’RACEKit，2ndGeneration(Roche)。将PsnRZF基因连接到植物表达载体pROKⅡ35S启动子后，用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化［17］，对转化植株进行RT－PCR的检测，分别检测非转基因和转基因烟草在正常生长和NaCl胁迫状态下的POD活性、SOD活性、MDA含量［18］，使用SPAD－502叶绿素仪测定样本叶绿素相对含量的变化情况。所得数据利用SPSS11．0统计软件进行单因素方差分析Duncan检验［19］。
2结果与讨论
2．1小黑杨环锌指蛋白基因全长
cDNA的克隆采用5’/3’RACE(rapidamplificationofcDNAends)的方法扩增PsnRZF基因的5’/3’端，3’RACE得到一条630bp的条带(图1)，5’RACE得到一条404bp的片段(图2)，经电子拼接获得带有PolyA的全长cDNA序列为1061bp。采用NCBI中的ORF程序显示5’非翻译区为184bp，3’非翻译区为82bp，开放读码框为795bp，编码264个氨基酸。用NCBI的保守功能区域(conserveddomains)分析程序预测基因的保守区，结果表明该基因编码产物属于环锌指蛋白超家族，保守区位于第58～104氨基酸。
2．2NaCl胁迫下小黑杨环锌指蛋白基因的表达分析
为研究小黑杨环锌指蛋白基因在盐胁迫下的应答，用Real－timePCR检测NaCl胁迫前后PsnRZF基因在根、茎、叶中表达的结果(图3)表明:在正常生长状态下，PsnRZF基因在根、茎、叶中均表达。在NaCl胁迫条件下，PsnRZF基因表达量在根、茎、叶中均升高，此基因在根中表达量变化并不显著。随着胁迫时间的延长，PsnRZF基因在茎和叶中的表达量逐渐升高。此基因在叶中表达量的变化最为明显，在胁迫后第2天和第4天显著高于对照(P＜0．05)，在胁迫后的第6天，此基因的相对表达量达到最高，极显著地高于对照(P＜0．01)。胁迫后的第4、6、8天，PsnRZF基因在茎中的相对表达量显著高于对照(P＜0．05)。小黑杨PsnRZF基因在不同器官中表达量变化存在差异，这可能是由于此基因编码的环锌指蛋白参与的很多生理反应主要是在叶中进行，如光呼吸，所以PsnRZF基因在叶中的表达量变化最为明显。随着NaCl胁迫时间的延长，PsnRZF基因的表达量也随之升高，说明盐胁迫影响了该基因的表达，PsnRZF可能在盐胁迫应答过程中发挥作用。植物在逆境胁迫时，体内会积累很多物质，如信号分子ABA，有研究表明环锌指蛋白可能参与ABA介导的信号转导过程。随着盐胁迫时间的延长，体内信号分子不断积累，PsnRZF基因表达量升高，作为信号受体的PsnRZF数目增多，PsnRZF作为信号受体与信号分子互作，从而调控盐应答基因的表达。但小黑杨环锌指蛋白(PsnRZF)与哪类信号分子互作，以及这种互作调控哪些基因的表达都有待进一步研究。
2．3小黑杨环锌指蛋白基因功能验证
本研究利用正向遗传学的方法来研究小黑杨环锌指蛋白基因(PsnRZF)的功能。将PsnRZF基因连接到植物表达载体pROKⅡ35S启动子后，用农杆菌介导法导入烟草，使其在烟草中过量表达，检测过量表达的PsnRZF基因对植物产生的影响，从而确定其功能。对转基因烟草的分子检测已经证明，PsnRZF基因已经导入烟草中，并在转录水平表达(图4)。通过表型观察发现，转基因烟草与非转基因烟草并无差别。正常生长条件下，多数转基因烟草的叶绿素含量低于非转基因烟草(图5)，转基因烟草MDA含量却高于非转基因烟草(图6)。这说明在正常生长条件下，PsnRZF基因的过量表达对植物体是有害的，这种伤害可能与氧化胁迫相关，导致膜脂的过氧化，因此转基因植株MDA含量高于非转基因植株。在盐胁迫下，非转基因植株SOD和POD活性迅速增强(图7、8)，有效清除活性氧。但非转基因烟草MDA含量仍高于正常条件下的水平，说明盐胁迫对非转基因烟草膜脂造成了伤害;而盐胁迫下转基因烟草MDA含量却低于正常条件下的水平，这说明环锌指蛋白对盐胁迫下的膜脂氧化有一定的抑制作用或参与膜脂过氧化后的修复。盐胁迫后，小黑杨环锌指蛋白发挥了与正常生长条件下不同的功能。环锌指蛋白具有E3泛素连接酶的活性，在正常生长与盐胁迫下，环锌指蛋白可能对不同的蛋白质进行泛素化修饰，从而执行不同功能［20］。
3结论
克隆获得小黑杨环锌指蛋白基因cDNA序列，全长1061bp，属于环锌指蛋白超家族基因。PsnRZF基因在不同器官中表达量变化存在差异，在叶中的表达量最高，其次为茎，在根中的表达量最低;在胁迫条件下，茎和叶中表达量呈现先逐渐升高后降低的变化趋势，而在根中，该基因表达量的变化不显著。在正常生长条件下，PsnRZF基因的过量表达可导致植物膜脂氧化程度增强;但在盐胁迫条件下，PsnRZF基因的过量表达可以缓解膜脂的过氧化作用。
4展望
本研究分析了PsnRZF基因的过量表达对植物的影响，在未来的工作中可以利用RNA干扰的方法使小黑杨环锌指蛋白基因沉默，观察小黑杨的变化，从而进一步研究小黑杨环锌指蛋白基因的功能，并且可以采用酵母双杂交的方法确定不同生长条件下环锌指蛋白与何种蛋白发生互作。本研究中，植物表达载体上的启动子为35S启动子，该通用型启动子有一定的局限性，在未来的育种研究中，建议将35S启动子替换成诱导型启动子，这样可以更好地调控PsnRZF基因表达，提高小黑杨的抗逆性。
作者：王雷 姜廷波 张介驰 单位：黑龙江省科学院 东北林业大学 黑龙江省科学院