视网膜PEDF表达及神经退变
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糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病致盲的主要原因，目前已有研究表明眼内血管形成刺激因子表达增多是DR发生的主要原因。DR在发生血管病变之前，视网膜电图、对比敏感度等已发生改变，即视网膜同时发生了神经退行性改变。色素上皮源性因子(pedf)作为一种天然的新生血管抑制剂及神经营养和神经保护因子，其表达是否在早期DR中发生改变从而参与某种作用值得探讨。本实验以链脲佐菌素诱导的糖尿病(DM)大鼠为研究对象，应用RT-PCR、Westernblot、TUNEL法及透射电镜等方法，观察DR发展过程中PEDF的表达及视网膜神经细胞的损伤情况，探讨非增生性及临床前期DR的发病机制。
1材料与方法
1．1实验动物与分组
健康雄性2月龄SD大鼠72只，清洁级，体质量200～250g，购自军事医学科学院实验动物中心，饲养于天津医科大学公共卫生学院实验动物中心，饲养环境符合医学实验动物环境设施要求。随机数字表法将大鼠随机分为5组，分别为DM0．5个月组、DM1个月组、DM3个月组、DM5个月组、正常对照组，其中正常对照组12只，其余各组15只。
1．2实验试剂和仪器
链脲佐菌素(Sigma公司，美国);PEDF多克隆抗体(sc-25594，SantaCruz公司，美国)。2400型PCR扩增仪(美国PE公司)，DU530型紫外/可见分光光度计(美国Beckman公司)，JE-OL-100CX型透射电镜(英国Instron公司)。
1．3实验方法
1．3．1DM模型制作
链脲佐菌素溶于0．1mol•L－1柠檬酸缓冲液(pH4．5)，一次性尾静脉注射(50mg•kg－1)制作DM模型，1周后取尾静脉血查血糖16．7mmol•L－1以上、尿糖强阳性者列为DM实验对象。实验期间大鼠标准饲养及饮食，定期观测血糖、尿糖及体质量。实验结束时，去除中间死亡鼠及血糖恢复鼠，每组以10只作为实验统计样本。
1．3．2标本采集
DM模型制作成功后，DM各组于相应时间点股动脉放血处死大鼠，迅速摘除眼球。每组取12只眼球去除眼前节，剥离视网膜组织，液氮速冻，置－80℃冰箱保存备用，分别行RT-PCR及Westernblot检测;每组另选6只眼球固定于福尔马林中行组织石蜡包埋、切片，行TUNEL原位细胞凋亡检查;每组其余2只眼球摘取视网膜组织制作电镜标本，行超微结构观察。
1．3．3RT-PCR检测视网膜PEDFmRNA表达
PEDFcDNA引物设计:上游引物:5’-TGTCTCAAC-CGGCAACATTC-3’，下游引物:5’-CAAGGAGGAG-GATGCTGAGG-3’，扩增片段409bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。取－80℃冻存视网膜组织提取总RNA，行RT-PCR反应，20g•L－1琼脂糖凝胶电泳。Bandscan5软件分析PEDF与β-actinmRNA光密度值，并以PEDF/β-actinmRNA光密度比值代表PEDFmRNA表达水平。
1．3．4Westernblot检测视网膜PEDF蛋白表达
取－80℃冻存视网膜组织，于细胞裂解液研磨，取上清液行视网膜总蛋白定量(BCA法)后，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(150g•L－1分离胶，50g•L－1浓缩胶)，半干法转膜，40g•L－1脱脂奶粉封闭过夜，加入1500稀释的PEDF多克隆抗体，加入11000稀释的β-actin单克隆抗体，4℃过夜，加入11000稀释的辣根过氧化酶标记的二抗37℃2h，化学发光法显影。Bandscan5软件分析PEDF与β-actin蛋白光密度值，并以PEDF/β-actin蛋白光密度比值代表PEDF蛋白表达水平。
1．3．5TUNEL原位细胞凋亡检查
取石蜡切片按TUNEL试剂盒使用说明进行视网膜凋亡细胞的检测。
1．3．6透射电镜观察
将视网膜标本固定、脱水、包埋、切片、电子染色后应用透射电镜观察视网膜超微结构改变。
1．4统计学分析
使用SPSS10．0统计软件，各组计量资料以均数±标准差(珋x±s)表示，应用单因素方差分析，组间的多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2．1视网膜PEDFmRNA表达
正常对照组大鼠视网膜即有PEDFmRNA的表达;DM0．5个月组PEDFmRNA表达未见明显改变，与正常对照组比较，差异无统计学意义(P＞0．05);随DM病程延长，PEDFmRNA逐渐减少，DM1个月组表达减少明显，与对照组比较，差异有显著统计学意义(P＜0．01);DM5个月组视网膜表达量约为正常对照组的1/2，差异有显著统计学意义(P＜0．01，见图1、表1)。
2．2视网膜PEDF蛋白表达
各组间大鼠视网膜PEDF蛋白的表达趋势与PEDFmRNA表达一致:正常对照鼠视网膜即有PEDF蛋白表达，随着DM病程延长，表达逐渐减少(图2、表1)。
2．3TUNEL染色结果
正常对照组、DM0．5个月组、DM1个月组大鼠视网膜未见TUNEL阳性细胞。DM3个月组视网膜神经节细胞层少量细胞发生凋亡。DM5个月组视网膜神经节细胞层及内核层部分细胞发生凋亡(图3)。
2．4透射电镜结果
正常对照组视网膜细胞结构清晰，胞质内细胞器丰富完整。DM0．5个月组:视网膜全层结构同正常对照组无明显差异，仅神经纤维层可见少量髓磷体结构。DM1个月组:内界膜基膜完整，部分神经纤维水肿，电子密度变低，神经微丝、微管结构消失，有的神经纤维内出现高电子密度的髓磷体结构，邻近的视网膜神经节细胞轻度水肿;视细胞膜盘排列尚规则，外界膜完整(图4)。DM3个月组:病变较DM1个月组加重，部分神经纤维水肿，髓磷体结构增多;有的视网膜神经节细胞开始出现核染色质边集，核膜结构清晰(图5);视细胞膜盘结构模糊不清。DM5个月组:病变进一步加重，神经纤维层近半数结构呈明显退行性改变，神经纤维膜及内容物降解，显示为低电子密度不规则空间，内含膜性碎片或髓磷体结构，严重病变的神经纤维镶嵌在相对较正常的神经纤维之间，使该部位呈筛孔状(图6);视网膜神经节细胞损伤降解严重，核内容物降解，仅留下“鬼影”，粗面内质网扩张，核糖体解聚，线粒体肿胀，嵴变短甚至消失，基质空化;部分视网膜神经节细胞皱缩，核固缩，染色质浓缩呈分叶状结构，与核膜分离，核膜完整;视细胞的内节、外节结构模糊不清晰;外核层细胞固缩呈串珠样排列，胞质大部分降解，几乎成为裸核，细胞间有很大的水间隙，内有髓磷体结构;外界膜依稀可辨，但结构已不完整。
3讨论
PEDF是从人胎儿视网膜色素上皮细胞条件培养液中首次分离、发现并命名的一种相对分子量为50×103的蛋白质，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超基因家族。已有临床研究证实增生性DR玻璃体及房水中PEDF表达显著降低，血管内皮生长因子表达增高，两种拮抗因子的失衡参与了视网膜病变的发生与发展［1］。然而对于非增生性病变，由于临床标本获取困难，限制了其研究的准确性。大部分研究认为DM早期PEDF的表达变化与增生性病变类似［2-3］，但Matsuoka等［4］研究表明，氟尿嘧啶自发性DM大鼠视网膜PEDF表达明显高于正常大鼠，考虑其与氟尿嘧啶自发性DM大鼠不易形成新生血管有关。
本实验结果显示正常大鼠视网膜即有PEDFmRNA及蛋白的表达，提示其在生理状态下发挥一定的作用。DM0．5个月组大鼠视网膜PEDF表达与正常对照组无明显差异，随DM病程延长，至1个月时PEDFmRNA及蛋白表达即开始减少。综合文献，PEDF表达降低的原因考虑有以下几点［5-7］:(1)高血糖可能是PEDF表达降低的原因之一;(2)随病变发展，视网膜缺血、缺氧加重，低氧可间接下调PEDF的表达。Müller细胞暴露于低氧环境下，也可导致PEDF释放减少;(3)体外培养的Müller细胞在受到外源性血管内皮生长因子刺激后24h，可呈剂量依赖性下调PEDF的表达。DR时视网膜血管内皮生长因子在血糖升高2周时表达即明显增高，因此Müller细胞可能通过自分泌的方式调节PEDF的表达。
有观点认为DR不仅仅是微血管病变，还是一种慢性神经元退行性疾病。在血管病变发生之前，其视网膜已经发生功能性改变，视网膜电图表现为振荡电位的潜伏期延长、波幅降低，临床表现为夜视力降低、对比敏感度减退。同时随着病程的延长，视网膜细胞可发生凋亡改变［8］。本实验表明在DM病程延长过程中，内层视网膜细胞同时发生了凋亡和坏死，外层视网膜细胞主要表现为坏死的特征。发病初期，通过透射电镜我们观察到仅视网膜神经纤维层及神经节细胞层部分结构发生轻微改变，随病程延长，病变加重，同时损伤由内层视网膜延至外层视网膜。
研究表明，PEDF除了是一种天然的血管形成抑制剂外，还是一种重要的细胞外神经营养因子，对神经组织的发育和分化发挥重要作用，能够促进无视网膜色素上皮细胞支持的光感受器神经元的正常发育及视蛋白的表达，作为一种神经保护剂还能够延迟遗传性视网膜变性小鼠光感受器的死亡，保护光感受器免于过氧化及光的损伤，同时还可对抗视网膜的缺血性损伤［9］。Yoshida等［2］研究发现应用PEDF可减少早期DM大鼠视网膜电图的a波及b波波幅改变，并可通过抑制NADPH过氧化活性而减轻神经元退行性改变。Shen等［10］也发现PEDF可增加视网膜谷氨酰胺合成酶的表达，从而降低视网膜谷氨酸浓度，对早期DR起一定的保护作用。因此我们可以推测DM早期PEDF降低对视网膜神经退行性改变发挥了重要的作用。有研究表明DM1个月龄大鼠视网膜神经节层及外核层细胞发生凋亡［11-12］，我们也发现DM早期大鼠视网膜发生退行性改变，而此时PEDF表达减少，同时PEDF的受体恰表达于光感受器层及神经节细胞层［13］，提示二者之间可能存在密切联系。
微血管病变是DR的一个主要临床表现，然而在此之前或与之伴行，视网膜从内界膜至色素上皮层均发生了组织结构的破坏，表现为神经退行性改变。在非增生性DR，PEDF的表达减少，提示其可能参与了早期神经退行性病变及微血管病变的发生。PEDF作为一种天然的、多功能的神经因子，通过局部用药或基因转染等途径增加其在DR中的表达，可能会为临床DR的预防及治疗提供新的途径，这有待于进一步的实验证实。