TGF―α、VEGF在皮肤鳞状细胞癌中表达及其与微血管密度的相关性研究
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摘要：目的 探讨转化生长因子α（tgf-α）及血管内皮生长因子（vegf）在皮肤鳞状细胞癌患者皮损血管生成机制中的作用。方法 采用SP免疫组化法检测皮肤鳞状细胞癌患者皮损处TGF-α、VEGF及微血管密度（MVD）的表达情况，并以正常人皮肤作对照。结果 皮肤鳞状细胞癌患者皮损处TGF-α、VEGF的表达及MVD值显著高于正常对照组（P
关键词：皮肤鳞状细胞癌；TGF-α；VEGF；MVD
Abstract：Objective To explore the effect of TGF-α and VEGF in the mechanism of the angiogenesis of squamous cell carcinoma.Methods SP immunohistochemistry was used to detect the the expression of TGF-α，VEGF and MVD from samples of squamous cell carcinoma tissue. Meanwhile，those factors were detected in normal skin tissue as control. Results The expression of TGF-α，VEGF and MVD in squamous cell carcinoma tissue group were signifcantly higher than those in the normal group （P
Key words：Squamous cell carcinoma；TGF-α；VEGF；MVD
皮肤鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）是由表皮和（或）附属器角质形成细胞发展演变的一种恶性肿瘤，因此又叫表皮样癌，具有浸润性生长特性。目前研究表明，皮肤鳞状细胞癌皮损处暴露部位微血管密度（MVD）之所以增加，是因为患者过度地接受外界的光刺激，大量地接受紫外线辐射更增加了上皮细胞癌变发生的几率，上皮癌细胞分泌的血管形成因子是促使血管形成的间接因素，微血管生成异常与SCC的发生、持续存在有密切关系，在SCC的发病机制中起重要作用[1]。体外实验发现TGF-α可以诱导角质形成细胞产生VEGF，二者可能在血管增生中起协同作用[2]。本研究通过检测SCC皮损中TGF-α、VEGF、CD34表达，旨在探讨TGF-α、VEGF与微血管密度（MVD）相互关系及其在SCC发生中的作用。
1 资料与方法
1.1一般资料 2014年1月～2015年10月我院皮肤科门诊的SCC患者20例，均经组织病理检查确诊，其中男14例，女6例，年龄35～80（59.7±15.6）岁，病程1月～18.5（6.8±4.9）年。根据Broders病理法判断分级：I级6例，II级7例，III级7例，1V级0例，所有病例均未发生淋巴结转移和远处转移。正常对照组20例，均为整形外科及骨科手术的非银屑病患者的皮肤，男12例，女8例，年龄30～78（57.8±13.2）岁，所有标本均有详细完整的病历存档。两组年龄、性别等均无统计学差异，可以进行统计学分析比较（P>0.05）。
1.2方法
1.2.1使用试剂 鼠抗人CD34单克隆抗体、兔抗人VEGF单克隆抗体、鼠抗人TGF-α单克隆抗体（所有试剂均有北京中杉金桥生物技术有限公司生产）和即用型SP免疫组化试剂盒也购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2.2操作方法与评定标准 在皮损处取1cm×1cm大小的标本，深度可达脂肪层，4～5mm厚度。选择固定液体，浓度为10%的中尔马林液，容量一般为标本体积的10～20倍，用石蜡将包埋，然后切片，SP免疫组化染色，可以根据试剂盒内的说明书来进行操作。对TGF-α、VEGF进行染色处理，要确保在每张切片上都能对TGF-α、VEGF进行整体观察，可以选择5个代表性区域，每区200个细胞，在400×倍视野下进行观察。阳性细胞数计分标准：阳性数不超过5%的比例计为0；阳性数在6%～35%计为1；阳性数在36%～70%计为2；阳性数超过70%的比例计为3。着色强度计分标准：0为不着色，1为弱着色（淡棕黄色），2为强着色（显著棕黄色）。阳性分级标准：上述两项相加，≤2分为阴性（-），3分为弱阳性（+），4 分为中等阳性（++），5分为强阳性（+++）。MVD：染色后呈棕黄或棕褐色、分界清楚的内皮或内皮细胞团簇均可以作为一个血管计数，在100倍光镜下，对每张切片选择血管分布最高区域者，在200倍光镜下，选择5个视野，计算微血管的个数，并计算其平均值，得出单位面积的MVD值。
1.3统计学处理 使用SPSS 11.0统计学软件对数据进行统计学分析处理，计量资料以（x±s）的形式表示，组间数据比较采用随机t检验，组内数据比较采用配对t检验；数据的相关性分析用Sperman处理。
2 结果
2.1 SCC皮损中与正常皮肤组织中TGF-α和VEGF表达结果的比较：TGF-α在细胞质中表达的量较大，在细胞核中少量表达，在SCC皮损中的表达强度与正常皮肤组织中的表达强度比较差异，具有统计学意义（P
2.2皮损组与正常对照组中CD34和MVD的比较：CD34在真皮浅层小血管内皮细胞胞浆中表达，呈环状或条状，弥漫分布，正常对照组的CD34与SC皮损组CD34在真皮层中血管内皮细胞胞浆中的表达均呈阳性；皮损组MVD计数为（25.76±5.86），明显高于正常对照组的（7.25±2.79），两组比较具有统计学差异（t=12.75，P
2.3 SCC皮损中TGF-α、VEGF与MVD相关性：SCC患者皮损中的TGF-α、VEGF表达与MVD呈正相关（r=0.668， r=0.720，均P
3 讨论
皮肤鳞状细胞癌起源于表皮或其附属器角质形成细胞（keratinocyte，KC）的皮肤恶性肿瘤，其病因复杂，约占皮肤恶性肿瘤的60%左右，发病机制尚不十分清楚。皮肤鳞状细胞癌微血管异常包括真皮浅层明显的微血管扩张，内皮细胞增殖及血管生成。原发皮肤肿瘤的新生血管化程度与肿瘤侵袭性及预后存在相关性，为一独立的预后因素。在众多引起血管生成的诱导剂中，血管内皮生长因子（VEGF）是目前发现的一类作用最强，特异性最高的促新生血管形成因子，它是内皮细胞选择性的有丝分裂原，对内皮细胞具有特异性，可改变内皮细胞的基因表达，特异性引起血管内皮细胞分裂增殖、通透性增加，促进内皮细胞、单核细胞迁移，诱导血管生成及炎细胞浸润，从而诱导血管生成及炎症反应[3，4]。Maiolino等[5]检测犬皮肤SCC中VEGF的表达情况，在所有SCC中都发现有VEGF的存在，提示VEGF可能成为评估皮肤SCC肿瘤恶性程度和生长潜力的重要指标。TGF-α是表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）家族的重要成员之一，编码基因定位于2号染色体，是EGFR的配体，由角质形成细胞生成，可以自分泌的方式与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）结合促进角质形成细胞的有丝分裂，其作用是刺激上皮细胞增生并诱导组织细胞生长及转化作用。RT-PCR研究发现在SCC和BCE的邻近表皮（距肿瘤边缘2～3mm的表皮）内TGF-α mRNA表达是正常皮肤的2.0～2.7倍；SCC中瘤组织TGF-α mRNA表达是正常皮肤的4.9倍，而其在BCE中表达仅为正常皮肤的78%，TGF-α在SCC中的高表达为其生长提供了基础[6]。CD34抗原是一种阶段特异性白细胞分化抗原，作为普遍认同的细胞标记物，它存在于血管的内皮。因此，能够很清晰地把毛细血管的形态显示出来，使用CD34来标识血管内皮，能够测算出MVD，而MVD又能够反应出新生的微血管的增长态势，能对血管的生成进行定量计算，CD34在众多血管内皮细胞标记物中比较敏感，更具有特异性，观察也比较方便[7]。TGF-α、VEGF可以旁分泌或自分泌方式影响肿瘤的生长与转移，许多皮肤肿瘤可产生TGF-α、VEGF，但皮肤肿瘤中TGF-α、VEGF表达及其与MVD的关系研究较少。
本研究结果表明，正常人表皮各层均有TGF-α弱表达，诱导表皮细胞正常的生长及转化。在SCC组织表皮各层中的表达强度均显著强于正常对照组，提示TGF-α通过自分泌调节方式刺激和加速角质形成细胞的形成和生长，表明TGF-α在SCC的发展和持续过程中可能起着一定的作用。其机制可能是[8]：EGFR效应器（Erk1/2、Akt）激活见于SCC癌细胞和SCC、BCE邻近表皮，表达过度的EGFR和存在过量的TGF-α互相发生作用，EGFR和TGF-α相结合后的受体结构产生二聚体化和自身磷酸化效应，EGFR被活化，同时激活下游的信号传导通路，受体上的酪氨酸激酶（PTK）也被激活，然后再激活MAPK信号系统，信号传导因子细胞外调节蛋白激酶（EPK）通路被激活，然后进入细胞核，使得转录因子被磷酸化，DNA合成增加，促使细胞发生分化增殖，EGFR信号转导参与化学物质和癌基因诱导的皮肤癌变。我们的实验也发现，在SCC患者皮损中血管内皮细胞和正常人表皮角质形成细胞同时表达VEGF，在SCC组织表皮各层中的表达强度均显著强于正常对照组，提示VEGF在SCC的发病机制中起到了重要的作用。张锡宝等[9]研究表明 VEGF 在 PS 患者皮损及非皮损中的角质形成细胞中过度表达，而在正常人中几乎未见表达，且与 PS 的病期及疾病严重程度有关，与我们的研究结果相符。SCC中VEGF介导的血管生成过程机制可能是：①角蛋白细胞（Keratinocytes，KC）在受到缺氧等各种刺激后通过自分泌或旁分泌释放细胞因子，促进VEGF表达，同时缺血缺氧也能导致VEGFR数量增加和功能增强，又由于有正反馈作用，VEGF的浓度增高又上调了VEGFR 的表达。当高浓度的VEGF与VEGFR结合后，通过络氨酸激酶介导的信号转导使胞内发生一系列改变，促使血管通透性增加及血管内皮细胞增生、迁移，最终导致新生血管形成[10]；②EGF与血管内皮细胞上的特异性受体Fit-1和激酶插入嵌合受体（kinase insert domaincontaining receptor，KDR）结合，激活受体内的酪氨酸激酶，引起一系列信号传导，促使血管通透性增加及血管内皮细胞增生、迁移，最终导致新生血管形成[11]。本研究结果还显示，SCC患者皮损中MVD值较低正常对照组显著升高。SCC皮损中TGF-α、VEGF表达与MVD相关性结果显示，TGF-α和VEGF的表达与MVD值呈明显正相关，TGF-α与VEGF的表达也呈正相关，表明SCC患者皮损中TGF-α和VEGF可能发挥协同作用，促进血管新生从而促进SCC的发生。
总之，对SCC血管生成的研究有助于揭示SCC的发病机制，并指导临床治疗。综合我们的研究结果表明，检测TGF-α、VEGF与CD34在SCC皮损中的表达以及与MVD的相关性研究，对进一步了解SCC血管生成情况以及为抗SCC新药开发提供新的药物靶位。
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