钾电流在甲基苯丙胺引起神经元损伤中的作用
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DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.11.007
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81072329）； 国家自然科学基金青年基金（81202230）； 南京医科大学科技发展基金（2011NJMU275）；江苏省高校优势学科建设工程资助项目（JX10231801）
作者单位：210029 南京，江苏省人民医院急诊科（蒋雷、张劲松）；南京医科大学（王军、高蓉、肖杭）；蒋雷、王军对本文贡献度相等
通信作者：张劲松，Email：
【摘要】目的 探讨甲基苯丙胺（Meth）对外向钾电流的影响及外向型钾通道在Meth引起的海马神经元损伤过程中的作用。方法 以分离出的怀孕18 d Sprague-Dawley大鼠胎鼠的海马神经元作为实验对象，分为对照组和Meth处理组，采用全细胞膜片钳的实验方法，分别记录Meth处理后外向4-AP和TEA敏感型钾电流大小的变化。通过MTT和TUNEL的方法，观察Meth作用后引起的电流变化对海马神经元活力和凋亡的影响。统计分析利用单因素方差分析结合LSD- t 检验，以P
【关键词】甲基苯丙胺；4-AP敏感型钾通道；TEA敏感型钾通道；细胞凋亡；海马神经元
The involvement of outward potassium currents in methamphetamine-induced hippocampal neuron damage in fetal rat JIANG Lei*， WANG Jun， GAO Rong， XIAO Hang， ZHANG Jin-song. *Department of Emergency Medicine， First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210029， China
Corresponding author： ZHANG Jin-song ， Email ：
【Abstract】Objective To investigate the effects of methamphetamine（Meth）on the outward K+ currents and elucidate the role of outward K+ channels in Meth induced hippocampal neuron damage. Methods Hippocampal neurons were harvest from 18-day-old embryonic rats and were divided into two groups： the control group and the Meth treated group. Both of 4-AP and TEA sensitive K+ currents were recorded after the treatment of Meth by performing the whole cell patch clamp. Furthermore， the MTT and TUNEL assays were performed to evaluate the effects of K+ channel on hippocampal neuron damage mediated by Meth. For statistical comparison， One-way ANOVA and LSD multiple comparison test or t -test was used.P-value
【Key words】Methamphetamine； 4-AP sensitive K+ channel； TEA sensitive K+ channel； Cell apoptosis；Hippocampal neurons
甲基苯丙胺（Meth）俗称冰毒，因其易制、低价，吸食后欣持续时间长等特点在吸食人群中“广受欢迎”[1]。中枢神经系统是Meth作用的重要靶器官之一，Meth的滥用会引起一系列神经系统，导致学习记忆＼注意力和决断能力的下降甚至缺失[2-3]。影像学研究表明，长期使用Meth会导致脑灰质部分细胞的缺失，海马萎缩以及脑白质小胶质细胞的激活，但其机制仍不明确[4-5]。越来越多的研究表明，钾离子通道对细胞体积的维持起重要作用。钾离子的持续性外流会引起细胞的皱缩，最终导致细胞凋亡[6-7]。对甲基苯丙胺与钾通道关系的研究，国内外鲜有报道。因此，基于以上钾离子通道在维持细胞体积中的重要作用结合Meth引起海马萎缩这一现象，在本研究中，笔者以钾离子通道作为研究靶点，探讨甲基苯丙胺对外向钾电流的作用，阐述钾离子外流与神经元凋亡损伤的因果关系，以期为Meth的干预提供新靶点和依据。
1 材料与方法
1.1 细胞、试剂与溶液
清洁级18 d SD孕大鼠由南京医科大学实验动物中心提供。HBSS缓冲液购自cellgro （美国）， 2.5%的胰酶购自HyClone（美国），兔抗大鼠MAP-2抗体购自Chemicon（美国），Alexa Fluor-594标记的羊抗兔二抗来自Invitrogen（美国），TUNEL试剂盒（In situ cell death Detection Kit， Fluorescein） 购自Roche（美国），荧光包被液（含DAPI）购自VECTOR（美国）。DNAse （2000 U/mL）、MTT、Methamphetamine、钾离子通道抑制剂4-AP、TEA均购自Sigma（美国）。
无血清培养液中Neurobasal medium、B27、青链霉素（100 U/mL）、胎牛血清均购自Gibco（美国）， 谷氨酰胺（0.5 μmol/L）购自Sigma。
电极内液（mmol/L）：K-gluconate 120， KCl 10， NaCl 5， CaCl2 1， MgCl2 2， EGTA 11，HEPES 10，Mg-ATP 2，GTP 1。KOH调节pH值至7.3。
电极外液 （mmol/L）： NaCl 140， KCl 5， CaCl2 2.5， HEPES 10， glucose 10， TTX 1 μmol/L。NaOH调节pH至7.3，渗透压为300～310 mOsm（1 mOsm/L=2.57 kPa）。以上内外液所有成分均购自Sigma。
1.2 海马神经元的分离和鉴定
1.2.1 海马神经元的分离 参照姜骏等[15]的方法，略有改进。小心取出海马组织，置于冰浴的HBSS液中；吹打使其初步分开；加入2.5 %的蛋白胰酶 1 mL，同时加入100 μL的DNAse，用HBSS稀释10倍后37 ℃消化15～20 min，以胎牛血清中和，吹打细胞，使其充分分离，离心；细胞取出后加入HBSS液，吹打使细胞分离，先后经100 μm和40 μm网筛过滤。离心，弃上清，加入5 mL培养液，吹打使细胞悬浮。计数，以适当密度接种于培养皿中，每3 d进行细胞的换液。
1.2.2 海马神经元的鉴定 利用兔源性抗大鼠神经元特异性标志物MAP-2的抗体与细胞4 ℃孵育过夜，然后加入Alexa Fluor-594标记的羊抗兔二抗，最后滴加防荧光猝灭含DAPI复合染料。神经元的纯度=MAP-2红染细胞数/DAPI蓝染细胞总数×100%。
1.3 电极制备
记录用的微电极用硼化玻璃毛细管（内径 1.6 mm，美国WPI公司）经微电极二步拉制仪（Sutter，P-97，美国）两步拉制而成。充灌内液后，电极电阻阻抗为3～6 MΩ。
1.4 全细胞膜片钳记录
采用全细胞电压钳记录模式（voltage-clamp recordings），参考电极为Ag-AgCl 电极，利用AXON 1440A数模转换器对信号进行收集，采集和滤波频率分别为5 kHz和1 kHz，所记录的电流经放大器（Axon 200B，美国）放大后，采集储存于计算机中。系统电阻、漏电流和电容电流由手动补偿，慢电容补偿率75%～80%。所有的记录均在室温（21±2）℃下完成。
1.5 MTT检测细胞活性
各组细胞处理后，在96孔板中，逐孔加入10 μL MTT磷酸缓冲液（2 mg/mL），2 h后，去上清液，加入100 μL DMSO，摇床（福玛，中国上海）摇匀，570 nm波长处测定吸光值。
1.6 TUNEL实验检测细胞凋亡
实验步骤参照试剂盒说明。凋亡细胞呈现绿染，DAPI染核呈蓝色，荧光显微镜在400倍放大倍数下，各处理组随机选取10个视野，平行双样，重复3次，计算各处理组凋亡率=绿染细胞数/DAPI蓝染细胞总数×100%，将对照组细胞的凋亡率标化为1，进行各组间细胞凋亡的比较。
1.7 统计学方法
所有数据以均数±标准差（ x±s ）表示，由Clamfit 10 （Axon Instrument，USA），Origin8 （OriginLab， Northampton，MA）和SigmaPlot （Jandel Scientific，CA） 软件分析处理，应用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t 检验，以P
2 结果
2.1 海马神经元的鉴定
海马神经元体外培养8～10 d后，利用抗神经元特异性标志物MAP-2的抗体对神经元进行标记，图1A显示的红染细胞为神经元，图1B为细胞核染色，图1C则显示了神经元数占总细胞数比例，其纯度达90%以上，符合后续实验的要求。
A：MAP-2抗体特异性结合于神经元细胞；B： DAPI核染；
C：合并图
图1 神经元的鉴定（×200）
Fig 1 Identification of the neurons（×200）
2.2 Meth 对海马神经元形态学的影响
分别利用100 μmol/L和1000 μmol/L的Meth处理培养8～10 d的海马神经元，光镜下观察细胞形态学变化。100 μmol/L Meth作用细胞48 h后（图2B），少量神经元细胞开始退化/变性，胞内出现空泡，细胞变形以及悬浮的细胞碎片出现，而1000 μmol/L Meth作用相同时间后，与对照组比较（图2A）细胞皱缩，细胞立体感消失，同时伴随着大量细胞碎片的产生（图2C）。
A：对照组海马神经元形态；B：细胞孵育100 μmol/L Meth 48 h后形态；C：细胞孵育1000μmol/L Meth 48 h形态
图2 Meth对海马神经元形态学的影响（×200）
Fig 2 The effects of Meth on hippocampus neuron morphology（×200）
2.3 Meth对TEA敏感型钾电流的作用
钾通道在维持细胞体积和形态中发挥着重要作用[8]。以上形态学结果表明，Meth作用后，细胞形态产生明显变化。基于此，笔者探讨了Meth对外向钾电流是否存在作用。研究表明，外向钾电流主要包含两种电流成分即瞬时外向和延迟整流型成分，前者可被4-AP拮抗，称之为4-AP敏感型钾电流，后者可被TEA阻断，称之为TEA敏感型钾电流[9-10]。在该实验中，细胞与100 μmol/L 的Meth孵育16 h后，在含有5 mmol/L 的4-AP的外液中进行电流记录。给予一个80 mV去极化，持续时间为200 ms电压，记录到TEA敏感型钾电流（图3A和B）。图3C则显示了在80 mV这一去极化电压作用下，对照组[（77.02±13.31）pA/pF， n =7]和Meth处理组[（76.42±11.46）pA/pF， n =6] 钾电流密度的大小。两组数据比较， t 值为0.075，Meth未引起TEA敏感型钾电流的增大（P>0.05）。
A：对照组TEA敏感型钾电流；B：Meth处理后TEA敏感型钾电流；C：对照组与Meth处理组TEA敏感型钾电流密度的比较
图3 Meth对TEA敏感型钾电流的作用
Fig 3 The effects of Meth on the TEA sensitive K+ currents
2.4 Meth对4-AP敏感型钾电流的作用
对外向钾电流中另一电流成分4-AP敏感型钾电流进行探讨。细胞与100 μmol/L 的Meth孵育16 h后，在含有20 mmol/L TEA的外液中进行4-AP敏感型钾电流的记录。图4A和B显示了典型的4-AP敏感型钾电流，图4C则显示了对照组和Meth处理组4-AP敏感型钾电流的电流密度，与对照组[（87.4 ± 12.5）pA/pF， n =10]比较，Meth能明显增大4-AP敏感型钾电流的大小[（120.1 ± 19.6）pA/pF， n =7]， t 值为-4.12，差异具有统计学意义 （P
与对照组比较，aP
图4 Meth对4-AP敏感型钾电流的作用
Fig 4 The effects of Meth on the 4-AP sensitive K+ currents
2.5 Meth对4-AP敏感型钾电流特异性的作用
为判断Meth对4-AP敏感型钾电流的作用是否具有特异性，利用多组浓度的Meth（0、30、100和300 μmol/L）作用于海马神经元，图5A、B、C和D分别显示了不同浓度Meth引起的4-AP敏感型钾电流的电流幅度，随着Meth浓度的增加，4-AP敏感型钾电流随剂量依赖性增大，100 μmol/L Meth[（95.4±17.8）pA/pF， n =7]和300 μmol/L Meth 处理组[（117.8±16.9）pA/pF， n =7] 与对照组[（74.7±10.5）pA/pF， n =8]比较， F 值为13.13，差异具有统计学意义。
与对照组比较，aP
图5 Meth和4-AP敏感型钾电流剂量效应关系
Fig 5 The relationship of dose-effect between Meth and the 4-AP sensitive K+ current
为进一步证明Meth特异性作用于钾离子通道，在细胞外液中加入25 mmol/L的KCl，相应外液中NaCl浓度则减少为115 mmol/L， 电流在含有TEA的外液中记录。结果表明，高浓度的KCl溶液能有效抑制由Meth引起的4-AP敏感型钾电流的大小，Meth+KCl处理组：（96.0±12.4）pA/pF vs. Meth处理组：（128.3 ± 25.2）pA/pF， n =6， F 值为9.87，而25 mmol/L KCl处理组与对照组，KCl处理组：（82.8 ± 10.0）pA/pF vs. 对照组：（75.5±16.50）pA/pF； n =6）比较，差异无统计学意义（图6）。
与对照组比较，aP
图6 高浓度钾溶液对Meth引起4-AP敏感型钾电流变化的影响
Fig 6 The effects of high K+ solution on Meth induced 4-AP sensitive K+ current
2.6 Meth通过4-AP敏感型钾通道对神经元的
损伤作用
由以上Meth引起钾离子外流等结果，笔者推测，Meth可能会通过钾通道，引起神经元的损伤。利用多组浓度的Meth（0、10、30、100、300和1000 μmol/L）作用于海马神经元48 h后（图7A），发现Meth浓度依赖性的降低神经元的活力，分别为（100.07±3.36）%，（95.56±0.08）%，（92.45±0.24）%，（90.66±1.89）%，（86.20±3.52）%和（45.69±3.37）%， F 值为54.23。而钾通道抑制剂4-AP（1 mmol/L）或25 mmol/L的KCl溶液能明显抑制1000 μmol/L Meth引起的细胞活力的降低，Meth处理组：（48.72±4.38）%， Meth+4-AP处理组：（61.39±3.15）%， Meth+KCl处理组：（78.25±9.42）%，P
与对照组比较，aP
图7 4-AP敏感型钾通道在Meth引起海马神经元中的作用
Fig 7 The effects of 4-AP sensitive K+ channel on Meth induced neural damage
为进一步阐述Meth对海马神经元的损伤及4-AP敏感型钾通道在Meth引起细胞损伤中的作用，笔者利用TUNEL的实验方法观察Meth（1000 μmol/L）作用48 h后神经元凋亡的情况（图8）。结果表明，Meth处理组中神经元凋亡数与对照组比，明显增多[Meth处理组（7.11 ± 0.95）vs.对照组（1.00 ± 0.18）]， F 值为67.50。而钾离子通道拮抗剂4-AP可部分抑制由Meth引起的神经元的凋亡[Meth+4-AP处理组（4.96 ± 1.32）vs.Meth处理组（7.11 ± 0.95）]，类似的现象在25 mmol/L KCl处理组中亦得到证明[Meth+KCl处理组（3.27 ± 1.14）vs.Meth处理组（7.11 ± 0.95）]。
与对照组比较，aP
图8 4-AP敏感型钾通道在Meth引起细胞凋亡中的作用
Fig 8 The involvement of 4-AP sensitive K+ channel in Meth induced cell apoptosis
3 讨论
截至2007年，全球范围内有1500～1600万的人吸食Meth，该的滥用已成为国际重大的公共卫生问题[1]。有研究显示，Meth的长期使用会导致一系列精神和神经系统性疾病。如Meth能特异性作用于黑质-纹状体、海马等组织，引起多巴胺能神经元内多巴胺耗竭，导致“帕金森样疾病”[11]。目前，神经兴奋性毒性、氧化应激、炎症反应等被认为是Meth引起细胞损伤的主要原因[12]，但其机制仍不完全清楚。
电压依赖性钾通道（Kv）是一大类广泛分布、种类繁多的离子通道，在调节静息膜电位，控制动作电位时程，影响神经元的重复放电的过程中发挥重要作用。免疫组化和原位杂交等实验方法显示该类通道在海马神经元中有较高密度的分布。现研究表明，钾通道还可参与调节细胞的形态和大小，与细胞的凋亡存在相关性。利用核磁共振技术，Thompson等[5]发现，Meth吸食者的海马组织明显萎缩。基于钾通道与细胞体积细胞凋亡之间的关系，该实验以海马神经元作为研究对象，观察了Meth对外向型钾电流的影响。结果显示，Meth可以增大4-AP敏感型钾电流，引起钾离子外流，最终导致海马神经元的损伤。
瞬时外向钾电流和外向整流钾电流是外向钾电流中两个最主要成分。前者对拮抗剂4-AP敏感，后者可被拮抗剂TEA拮抗。因此，本实验中，利用TEA将外向钾电流中延迟整流成分拮抗，可得到4-AP敏感型钾电流。结果显示，100 μmol/L的Meth可明显增大4-AP敏感型钾电流，而相同剂量的Meth未引起TEA敏感型钾电流的变化，提示4-AP敏感型钾通道主要参与了Meth引起的钾离子外流。不仅如此，笔者发现Meth能剂量依赖性增大4-AP敏感型钾电流，这一结果有力佐证了Meth对于4-AP敏感型钾通道作用的特异性。有报道证实，25 mmol/L的高钾溶液能降低胞内外K+浓度梯度，减少K+的外流[13-15]。依据此现象，笔者将细胞在高钾外液中孵育，观察Meth对钾电流的影响。结果显示，25 mmol/L KCl溶液明显抑制了Meth引起的钾电流的增大，该现象亦验证了Meth对钾通道的作用。
越来越多的证据表明，大量钾离子外流是细胞早期凋亡的现象。Pieri等[16]在建立的阿尔茨海默模型中，发现在β淀粉样蛋白片段诱导神经元凋亡前可引发外向延迟整流钾电流的增加，促进钾离子外流，而钾通道拮抗剂TEA则可明显减轻由淀粉样蛋白引起的神经元的凋亡。值得一提的是，β淀粉样蛋白片段同样可作用于瞬时外向钾通道Kv4.2和Kv4.4，使其表达上调，引起外向电流的增大。本研究结果表明，Meth能明显降低海马神经元的活力，而钾通道拮抗剂4-AP及25 mmol/L KCl溶液能明显降低Meth引起的细胞损伤，而另一钾通道拮抗剂TEA，未能显示出对细胞的保护作用，提示Meth引起神经元的损伤可能是通过瞬时外向这一类型钾通道来实现的。该结果与电生理中Meth引起4-AP敏感型钾电流增大，而对TEA敏感型钾电流未显示明显作用的结果完全一致。此外，通过TUNEL实验，亦验证了4-AP敏感型钾通道在Meth引起海马神经元凋亡过程中的作用。
总之，本实验首次报道了Meth通过4-AP敏感型钾通道这一靶点引起海马神经元的损伤，但由于目前市场缺乏特异性钾通道亚型的拮抗剂，未能就4-AP敏感型钾电流中某些具体亚型进行深入讨论，同时Meth如何引起4-AP敏感型钾电流增大等相关机制仍然未知，而对这些内容的探讨将有助于加深对钾离子通道尤其是对各亚型钾通道的认识，不仅可为Meth引起的神经损伤性疾病的防治提供新的理论依据和思路，亦可为神经损伤性疾病提供新的介入治疗靶点，具有重要的临床意义。
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（收稿日期：2013-05-21）