云南金钗石斛居群DALP遗传变异研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇云南金钗石斛居群DALP遗传变异研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

[摘要] 对云南7个金钗石斛居群和1个喇叭唇石斛居群，用5组dalp引物扩增得到140条清晰条带，其中102条为多态位点，多态比率72.86%，平均每组引物扩增所得多态条带为20.4。金钗石斛居群水平平均多态位点47.96%，多态位点在22.86%～68.57%；物种水平多态位点72.86%。DALP分析显示，金钗石斛物种水平的遗传多样性指数分别为PPB 72.86%，H 0.288 9，I 0.424 2；居群水平遗传多样性指数分别为PPB 47.96%，H 0.186 1，I 0.273 9。金钗石斛基因遗传分化系数Gst为0.338 6，即66.14%的遗传变异来自居群内，33.86%的遗传变异来自居群间，居群间存在较高水平的遗传分化。

[关键词] 金钗石斛； DALP； 遗传多样性

[收稿日期] 2013-03-14

[通信作者] 虞泓，教授，Tel：（0871） 65034655，Fax：（0871） 68182565，E-mail：，

金钗石斛Dendrobium nobile Lindl多年生草本，为兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium Sw植物。生于海拔500～1 700 m的山坡林中树上或路边岩石上。主要分布于云南、贵州、四川、湖北、广西、广东，海南岛和台湾等地[1-2]。金钗石斛为常用珍贵中药，在《神农本草经》中列为上品，具有滋阴清热，生津益胃，润肺止咳，明目强身等功效。现代药理学研究表明，石斛还具有抗肿瘤，抗衰老，增强机体免疫力，扩张血管及抗血小板凝集等作用[3-5]。在我国药典收载的5种石斛中，金钗石斛生物碱含量最高[6]。同时石斛在国际花卉市场上占有重要地位，具有很高的商业价值[7]。

Direct amplification of length polymorphisms （DALP）以通用测序引物M13为核心序列，在此基础上任意添加少数碱基形成引物，对样品基因组进行PCR扩增，得到相应的DNA指纹[8]。相比RAPD等分子标记，DALP包含了更多的信息量，有更高的可重复性和稳定性，是揭示生物居群遗传多样性及其遗传结构快速、有效、重复性好的可靠方法，适合于检测居群间和居群内的遗传变异[9]。DALP分子标记在物种鉴定、遗传多样性分析、系统与进化等研究得到广泛应用，可用来判断植物类群的分类地位、习性、系统、种子扩散机制、分布地区和演替阶段，对居群遗传分化程度的影响；近些年还被广泛应用于中草药植物遗传分析和药材鉴定，寻找中药材品种之间的遗传差异性[10-16]。

近年来，由于长期过度的开发，金钗石斛生境破坏和退化，加之生长缓慢等原因，金钗石斛也逐渐变为稀少。本研究试图利用DALP标记，对云南金钗石斛居群进行遗传结构和遗传分化分析，为金钗石斛种质资源的保护与可持续利用提供依据。

1 材料

金钗石斛7居群共83个个体分别采自贡山、景洪、思茅、腾冲、保山、屏边、文山等地区。以采自腾冲的喇叭唇石斛D.Lituiflorum居群10个个体，为比较。除景洪和思茅的部分个体外，试验所用样品均引种至云南昆明官渡区小哨乡白汉场英茂生物技术实验室基地（海拔2 100 m）。样品来源、编号和生境情况，见表1。

表1 金钗石斛和喇叭唇石斛居群的材料来源

Table 1 Origin of Dendrobium nobile and D.lituflorum

2 方法

2.1 金钗石斛的总DNA的提取 基因组DNA提取采用CTAB法[17]，并稍作修改。0.5 g左右的植物叶片放到研钵中，加入适量PVP和2% β-巯基乙醇迅速研磨成糊状，然后加入4 mL预热到65 ℃的2×CTAB（含2% β-巯基乙醇）中，65 ℃水浴1 h，冷却，加入1/3体积5 mol・L-1的KAc冰浴1 h，4 ℃ 7 000×g离心3 min，取上清，CI（氯仿-异戊醇 24∶1）抽提2次，取上清加 3/4 体积的异丙醇，-20 ℃静置30～60 min，12 000×g离心10 min，70%乙醇洗2次，无水乙醇洗1次。加400 μL 1×TE，室温静置2 h，使DNA 充分溶解，1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，用λDNA（25， 50， 100 mg・L-1）标定，利用Kodak 1D分析软件分析并标定到20 mg・L-1备用。

2.2 PCR扩增 反应体系：采用20 μL反应体系，其中模板DNA 60 ng， 2 μL 25 mmol・L-1 MgCl2，2 μL 10×Buffer， 1 μL 2.5 mmol・L-1 dNTPs （上海生工分装），4 μL 0.5 U・μL-1Taq酶（Shanghai Promega），1 μL 5 pmol选择性引物（上海生工合成），3 μL 5 pmol・L-1反向引物（上海生工合成）。引物序列见表2。本研究采用反向引物DALPR1分别与5个选择性引物组合进行DALP扩增。

表2 DALP引物组序号与序列

Table 2 Sequences of the primer groups

扩增程序：使用PE9700扩增仪（美国PE公司）。95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

产物检测：扩增产物在1×TBE，1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色， Kodak凝胶成像系统照像，检测DALP带型，再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染。

2.3 聚丙烯酰胺电泳 5%非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺29∶1），上样量5 μL（样品 6×上样缓冲液 5∶1）。电泳条件 Bio-Rad垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司） 1 000 V，150 min。

2.4 DALP银染 本实验采用快速银染法：①固定液（10%乙酸）洗脱直至溴酚兰颜色褪去，超纯水洗3次，每次不少于2 min。②染色液（0.1%的硝酸银，0.4%的甲醛） 染色40 min；水洗2 s立即拿出。③在显影液（3.0%碳酸钠，显影前加入0.4%甲醛，0.02% 10 g・L-1（硫代硫酸钠）中显影至带纹清晰，固定液（10%乙酸）固定5 min，超纯水洗10 min自然晾干，电泳图见图1。

图1 DALP电泳式样

Fig.1 The electrophoresis pattern of DALP

2.5 数据统计分析 利用Kodak 1D 分析软件分析，每个样品的扩增带按有或无记录，“有”赋值为1，“无”赋值为0，得到原始数据表征矩阵，弱带及重复性不好的条带不予统计。利用PopGene32共享软件统计多态条带比率（PPB），计算扩增产物的Shannon 信息指数，Nei′s 遗传相似系数，遗传距离（genetic distance），有效等位基因数（effective number of alleles），以及基因分化系数Gst等，同时结合Treeview软件对得到的遗传距离矩阵进行非加权配对算术平均法（UPGMA）聚类分析，构建聚类图。

3 结果

3.1 遗传多样性 金钗石斛7个居群，5组DALP引物扩增得到140条清晰条带，平均每个引物扩增条带数为28，其中102条为多态条带，多态比率为72.86%，平均每组引物扩增所得多态条带为20.4。7个居群的平均多态位47.96%，物种水平的多态位72.86%。其中思茅居群（NK）的多态位最高为68.57%，腾冲居群（NL）次之，为55.71%。居群的多态位在22.86%～68.57%，见表3。

在居群水平，平均观察等位基因数Na 1.479 6，平均有效等位基因数Ne 1.323 7，平均遗传多样性

表3 金钗石斛居群DALP遗传多态性

Table 3 Analysis of the genetic polymorphism of the 7 populations of Dendrobium nobile

指数H 0.186 1，平均Shannon 多样性指数I 0.273 9；在物种水平，Na 1.728 6；Ne 1.501 1；H 0.288 9；I 0.424 2，见表4。

表4 金钗石斛居群遗传多样性参数

Table 4 The parameters of population genetic diversity in Dendrobium nobile

3.2 遗传分化 总居群基因多样度Ht 0.281 3，各居群基因分化系数Hs 0.186 1，基因分化系数Gst 0.338 6。金钗石斛7个居群中，有66.14%的遗传变异来自居群内，33.86%的遗传变异来自居群间，居群间存在较高水平的遗传分化。

3.3 遗传关系 金钗石斛7居群和外类群喇叭石斛1居群中，贡山居群（NH）与腾冲居群（NL）之间的遗传一致度为最大值0.955 9，遗传距离为最小值0.045 1，这2个居群首先聚在一起，而金钗石斛各居群与外类群喇叭唇石斛NQ的遗传一致度最小，遗传距离最大。各居群的UPGMA聚类分析见图2。

4 讨论

4.1 金钗石斛居群间的遗传关系 UPGMA聚类图表明，7个居群的金钗石斛首先分别聚为3支，第1支是滇西地区的贡山居群（NH）、腾冲居群（NL）和保山居群（NN）； 第2支是滇东南地区的屏边居群（NP）和文山居群（NX）；第3支是滇南地区的景洪居群（NM）和思茅居群（NK）。金钗石斛7个居群的遗传距离与地理距离呈一定程度的正相关。这可能是由于较近的金钗石斛居群间基因交流发生的频率相对较高，使之保持了较近的亲缘关系。第1支滇西地区的贡山居群（NH）、腾冲居群（NL）和保山居群，与第2支滇东南地区的屏边居群（NP）和文山居群（NX））先聚在一起，此后才与第3支滇南地区的景洪居群（NM）和思茅居群（NK）相聚。滇西地区与滇东南地区的金钗石斛居群间，有相对较近的亲缘关系。这可能归因于在云南曾发生过的特殊地质事件[18]，但具体原因仍需结合兰科石斛属植物的起源与分化事件进一步深入研究。最后，外类群喇叭唇石斛（NQ）与金钗石斛各居群的遗传距离较远，位于UPGMA聚类图的最外一支。

图2 金钗石斛7个居群及喇叭唇石斛1个居群UPGMA聚类图

Fig.2 Dendrogram of 7 populations of Dendrobium nobile and 1 population of D.lituflorum by UPGMA

4.2 金钗石斛的遗传多样性 DALP分析显示，金钗石斛物种遗传多样性指数分别为PPB 72.86%，H 0.288 9，I 0.424 2；居群水平指数分别为，PPB 47.96%，H 0.186 1，I 0.273 9。

目前，分子标记检测遗传多样性的方法很多，如等位酶，RFLP，RAPD，AFLP，DALP等。在以往的研究中发现，同一物种采用不同的方法检测其遗传多样性会得到不同的结果，这种差异是由所采用的检测方法本身的灵敏度和其他一些因素决定的[19-20]。因此，要对一个物种的遗传多样性进行评价，应该建立在用同一方法对大量不同类群进行分析总结的基础之上。以往做过植物等位酶分析，为植物遗传多样性分析积累了较为丰富的资料，为判定某一特定植物遗传多样性的相对水平提供了依据[20-23]。

过去20年中，RAPD和AFLP等技术大量应用于植物遗传多样性和居群遗传结构，由于技术自身存在缺陷等原因，例如RAPD分子标记存在稳定性不好，重复性差[24-27]；AFLP分子标记不能确定连锁程度和位点的独立性，不能直接分开是选择还是居群间隔离导致的遗传变异[28]，而且费时费力费钱。

采用DALP分子标记技术对金钗石斛的遗传多样性水平进行评估，还需要用此方法对石斛属、兰科甚至更广泛的类群作对比研究。

与用DALP标记过检测过的物种相比，金钗石斛其物种水平和居群水平的遗传多样性处于较低的水平[10-16， 18-20]。

4.3 金钗石斛的居群遗传结构 金钗石斛基因分化系数Gst 0.338 6。表明有66.14%的遗传变异来自居群内，33.86%的遗传变异来自居群间，居群间存在较高水平的遗传分化。

造成金钗石斛居群间的分化程度较高，而遗传多样性较低的因素可能是，金钗石斛分布范围较广，其数目巨大的微小种子可借助风力或其他途径传播到很远的区域，在较连续的分布区域内，金钗石斛的居群间可有较频繁的基因流动。近年来，大规模的人工采集、生态环境的破坏、生境片段化，使得金钗石斛居群的个体数量急剧减少。这可能导致遗传漂变和近交等不利因素的发生，必然致使金钗石斛居群遗传多样性降低，居群间遗传分化加大。

金钗石斛具有较强的无性繁殖能力。在条件适宜的情况下，多年生的老茎上会萌发出许多新的幼小个体，新个体利用老茎的养分进行生长发育，在老茎枯死后，这些小个体落入周围的环境继续生长，在老茎周围形成无性繁殖系[29]。特别是在居群破碎，虫媒传粉不充分，不能很有效的进行有性生殖时，这种克隆生长的习性尤为明显。这也导致了遗传多样性的丧失和居群间的分化。

金钗石斛居群个体数在极短的时间内迅速下降，个体所携带的等位基因可能只是原居群基因库中很小的一次抽样，当它们得以恢复重建同类居群时，就会引发“奠基者效应（founder effect），从而使该居群遗传多样性迅速下降。过度采挖后残留下来的破碎居群，经过一段时间的隔离，缺乏基因交流，在各自的小环境中繁衍进化，加深了居群间的分化程度。

4.4 金钗石斛的保护策略 金钗石斛对生境要求严格、生长缓慢、有性生殖效率不高，人为掠夺采集和破坏更加剧了金钗石斛的濒危。在本研究的7个居群中，思茅和腾冲居群的遗传多样性较为丰富，这与当地自然保护区较为有效的管理和保护有一定的关系；在人为破坏比较严重的屏边居群中，金钗石斛表现出了较低的遗传多样性水平。因此，建议对金钗石斛野生资源应保护和恢复其栖息环境，采取措施帮助野生残留居群恢复重建；积极开展种质资源的收集保存工作，并对石斛属植物进行更全面深入的研究，为石斛资源的可持续利用提供理论指导和依据。

[参考文献]

[1] 吉占和， 陈心启， 罗毅波，等.中国植物志.第19卷[M].北京： 科学出版社，1999.

[2] 冉懋雄.名贵中药材绿色栽培技术――石斛[M].北京：科学技术文献出版社，2002：5.

[3] 张明，陈仕江，李泉森，等.金钗石斛驯化栽培的基质研究[J].中药材， 2001， 24（9）：628.

[4] 陈仕江，张明， 李泉森，等.植物生长调节剂对金钗石斛要用化学成分的影响[J].中草药， 2001， 32（10）：884.

[5] 杨显志，邵华，周成，等.生物技术在药用石斛研究中的应用[J].中草药， 2002， 33（2）：173.

[6] 张明， 陈仕江， 李泉森，等.不同栽培条件下金钗石斛总生物碱含量比较[J].中药材， 2001， 24（10）： 707.

[7] 卢思聪.中国兰与洋兰[M].北京：金盾出版社，1994.

[8] Desmarais E， Lannelus I， Lagnel J.Direct amplification of length polymorphisms （DALP）， or how to get and characterize new genetic markers in many species[J].Nucleic Acids Res， 1998， 26（6）：1458.

[9] Perrot Minnot M J， Lagnel J， Desmarais E，et al.Isolation and characterization by direct amplification of length polymorphisms （DALP） of codominant genetic markers with Mendelian inheritance in Neoseiulus californicus （Acari： Phytoseiidae） [J].J Exp Appl Acarol， 2000， 24：795.

[10] Ha W Y， Yau F C F， But P P H， et al.Direct amplification of length polymorphisms analysis differentiates Panax ginseng from P.quinquefolius[J].Planta Med， 2001， 67（6）587.

[11] 夏惠茵，游仲辉，王骏，等.直接扩增长度多态性技术在人参与西洋参鉴定中的应用[M]//劭鹏柱，曹晖.中药分子.上海： 复旦大学出版社，2004：119.

[12] 王琼，程舟，张陆，等.野山人参和栽培人参的DALP指纹图谱[J].复旦学报：自然科学版，2004，43：1030.

[13] 李永谊，虞泓，朱荣勋，等.红景天属植物的DALP反应体系的建立[J].中草药，2005，3（3）： 419.

[14] 王海英，虞泓，李南高，等.云南丽江山慈菇遗传多样性的DALP分析[J].云南植物研究，2005， 27（2）：156.

[15] 汤洪敏，吴刚，虞泓.云南野生大白口蘑遗传多样性研究[J].菌物学报， 2007，26（1）：128.

[16] 马云淑，李永谊，虞泓，等.正交实验法优化千金藤属植物的DALP反应体系[J].昆明医学院学报， 2007， 28（4）：31.

[17] Dolye J J， Dolye J L.A Rapid isolation procedure for small quantities of fresh tissue[J].Phytochem Bull， 1987， 19： 11.

[18] 李恒.掸邦――马来亚板块位移对独龙江区系的生物效应[J].云南植物研究， 1994，增刊Ⅵ：113.

[19] 吴刚，虞泓，梁淑云，等.云南川百合DALP遗传变异分析[J].广东农业科学， 2009， 7：52.

[20] Ma Y S， Yu H， Li Y Y，et al.A Study of genetic structure of Stephania yunnanensis （Menispermaceae） by DALP[J].Biochem Genet， 2008，46：227.

[21] Qu Y， Yu H， Wu G，et al.Genetic diversity and population structure of the endangered species Psammosilene tunicoides revealed by DALP analysis[J].Bio Chem Syst Ecol， 2010， 38：880.

[22] 李昂.三种兰科植物的保护遗传学研究[D].北京：中国科学院植物研究所， 2001.

[23] 王海英.丽江山慈菇遗传多样性及其保护研究[D].昆明：云南大学， 2004.

[24] 丁长春.杏黄兜兰及其近缘种的保护遗传学研究[D].昆明：云南大学， 2004.

[25] 毛钧.大百合居群遗传与进化研究――兼论百合族5属的系统关系[D].昆明：云南大学， 2005.

[26] Rajeev K V， Kamel C， Prasad S H，et parative assessment of EST-SSR， EST-SNP and AFLP markers for evaluation of genetic diversity and conservation of genetic resources using wild， cultivated and elite barleys[J].Plant Sci，2007，173 ：638.

[27] Skrede I， Carlsen T， Stensrud， et al.Genome wide AFLP markers support cryptic species in Coniophora （Boletales） [J].Fungal Biol，2012， 116：778.

[28] Excoffier L， Hofer T， Foll M.Detecting loci under selection in a hierarchically structured population[J].Heredity，2009， 103：285.

[29] 张明，银福军，陈仕江，等.金钗石斛根系的形态及解剖学研究[J].中国中药杂志，2001， 26（6）： 384.

Study on population genetic variation of Dendrobium nobile in

Yunnan by DALP

ZHANG Ming-yu， YU Hong YUAN Feng

（Yunnan Herbal Laboratory， Institute of Herb Biotic Resources， Yunnan University， Kunming 650091， China）

[Abstract] The Direct Amplification of Length Polymorphisms was applied to assess genetic diversity and structure of 7 populations of Dendrobium nobile， comparing one population of D.lituflorum.The five primer combinations were amplified to produce 140 clear bands， and 102 polymorphic bands had been detected with each pair of primer producing 20.4 polymorphic bands on average.At species level， the percentage of polymorphic bands （PPB） was 72.86%， the Nei′s gene diversity index （H） was 0.288 9， and the Shannon′s information index （I） was 0.424 2.At population level， the average PPB was 47.96%， H was 0.1861， and I was 0.273 9 in 7 populations.The coefficient of gene differentiation （Gst） was 0.338 6 among populations of D.nobile.It showed that 33.86% of the total genetic diversity was attributable to genetic differentiation among populations， while the rest 66.14% was resided between individuals within population.

[Key words] Dendrobium nobile； DALP； genetic diversity

doi：10.4268/cjcmm20132214