高氧液预处理对兔脊髓缺血损伤的保护作用及机制

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作者：桑韩飞，张英民，徐礼鲜，程虹，巩固，梅其炳，熊利泽

【关键词】 自由基

Protective effect of hyperoxic solution preconditioning on spinal cord ischemic injury in rabbits and its mechanism

【Abstract】 AIM: To investigate whether hyperoxic solutioin preconditioning has protective effect on spinal cord ischemic injury in rabbits and whether oxygen free radicals are involved in the protective effect. METHODS: Thirtytwo male New Zealands rabbits were randomly assigned to 4 groups (8 in each group): Control group (C ), hyperoxic solution preconditioning (H), dimethylthiourea (DMTU, free radicals scavenger) + hyperoxic solution preconditioning group (D+H) and DMTU group (D). In H group, hyperoxic solution 10 ml・kg-1 was infused intravenously at a rate of 30 ml・kg-1・ h-1 every day for 5 days; In the same way, C group were administred the same volume normal saline instead of hyperoxic solution; D+H group were treated the same as H group except for administering 500 mg・kg-1 DMTU intravenously 1h before each hyperoxic solution preconditioning; D group were administered 500 mg・kg-1 DMTU intravenously once a day for 5 days. 24 h after last preconditioning, the spinal cord ischemia was induced for 20 min by infrarenal aortic occlusion. Neurologic status was scored at 48 h after reperfusion. Then, all animals were sacrificed and the spinal cords (L57) were removed for histopathologic study. RESULTS: The neurologic function scores and the number of normal neurons of anterior horn of spinal cord were significantly greater in H group than in C group, D+H group and D group (P<0.05), which had no statistical differences between C group、D+H group and D group (P>0.05); There was a stong correlation between the neurologic function scores and the number of normal neurons in anterior horn of spinal cord （r=0.804, P<0.01). CONCLUSION: Hyperoxic solutioin preconditioning has a significant protective effect on spinal cord ischemic injury in rabbits and oxygen free radicals may be involved in the protective effect.

【keywords】 free radicals; hyperoxic solution; preconditioning; spinal cord; reperfusion injury

【摘要】 目的： 探讨高氧液预处理对兔脊髓缺血损伤是否有保护作用及氧自由基是否参与这种保护作用. 方法： 32只成年雄性新西兰兔随机分成4组(每组8只)，即对照组（C 组）、高氧液预处理组（H 组）、二甲基硫脲(DMTU, 自由基清除剂)+高氧液预处理组(D+H组)及DMTU组(D组). H组每天静脉给予10 mL・kg-1高氧液，20 min匀速泵完，连续5 d；C组用同样方法给予等容量生理盐水；D+H组在每次高氧液预处理前1 h静脉给予500 mg・kg-1 DMTU，其他处理同H组；D组每天静脉给予500 mg・kg-1 DMTU，连续5 d. 最后一次预处理结束后24 h，夹闭所有动物腹主动脉肾下段20 min，制作兔脊髓缺血模型. 再灌注后48 h, 对所有动物神经功能评分， 然后处死动物取脊髓（L57），制作标本行组织病理学观察. 结果： H组的神经功能评分和脊髓前角正常神经细胞数明显多于C组、D+H组及D组(P<0.05)；C组、D+H组及D组的神经功能评分和脊髓前角正常神经细胞数组间无明显差异(P>0.05)；神经功能评分与其对应脊髓前角正常神经细胞计数之间有显著相关性（r=0.804, P<0.01）. 结论： 高氧液预处理对兔脊髓缺血再灌注损伤有明显的保护作用，氧自由基可能参与这种保护作用.

【关键词】 自由基；高氧液；预处理；脊髓；再灌注损伤

0引言

脊髓缺血损伤所致截瘫是胸腹主动脉手术后的严重并发症，截瘫发生率在4%-33%之间［1］. 虽然人们提出许多技术性（主动脉转流术、脑脊液引流术及低温等）和药物性（自由基清除剂、谷氨酸释放抑制剂及阿片受体拮抗剂等）的防护措施［2］，但这些防护措施的效果仍然是有限的. 因此，寻找新的防护手段是一项亟待解决的课题. 目前的研究证实，缺血预处理对脊髓缺血损伤有显著的保护作用［3-5］，但由于实施困难，其临床应用受限. 研究用药物模拟缺血预处理,已成为发展趋势. 本实验旨在探讨高氧液预处理对缺血脊髓的保护作用及氧自由基是否参与这种保护作用.

1材料和方法

1.1材料新西兰大白兔由第四军医大学实验动物中心提供. 二甲基硫脲（dimethylthiourea, DMTU ）购于Fluka 公司. 高氧液用西安高氧医疗设备有限公司研制的“高氧医用液体治疗仪”制备，用量子化溶氧机制以生理盐水为载体，溶氧后可制成氧分压达到90～100 kPa及含微量臭氧的高氧液体.

1.2实验动物分组32只成年雄性新西兰大白兔，体质量2～2.5 kg，随机分成4组(n=8)，即对照组（C组）、高氧液预处理组（H组）、二甲基硫脲(DMTU, 自由基清除剂 ) +高氧液预处理组(D+H组)及DMTU组(D组). H组每天静脉给予10 mL・kg-1高氧液，20 min匀速泵完，连续5 d；C组用同样方法给予等容量生理盐水；D+H组在每次高氧液预处理前1 h静脉给予500 mg・kg-1 DMTU，其他处理同H组；D组每天静脉给予500 mg・kg-1 DMTU，连续5 d. 最后一次预处理结束后24 h，夹闭所有动物腹主动脉肾下段20 min，制作兔脊髓缺血模型.

1.3动物模型制作所有动物术前禁食过夜，自由饮水. 参照文献［6］的方法制作兔脊髓缺血模型. 即iv 30 mg・kg-1戊巴比妥钠麻醉动物后，经面罩吸入4 L・min-1氧气，分别经耳动脉及股动脉置管以监测近端动脉压及远端动脉压；普鲁卡因局麻开腹，暴露腹主动脉左肾动脉分支下段；于左肾动脉分支点以下1.0 cm处，放一环扎装置，用于阻断腹主动脉血流造成脊髓缺血. 缺血前经耳缘静脉给予400 U肝素. 扎闭腹主动脉20 min后去除环扎装置，恢复血流灌注. 检查血管无损伤后关腹. 术中持续监测心率、动脉血压及直肠温度. 用烤灯维持动物体温37.5～38.5 ℃. 分别于扎闭前即刻、扎闭后10 min和再灌注后20 min经兔耳动脉采血监测PaO2, PaCO2及血糖.

1.4神经功能评分在缺血再灌注后48 h由一不了解分组情况的观察者对动物后肢运动神经功能评分. 评分参照Tarlov［7］标准，分为5级：O分,后肢完全瘫痪；1分，后肢有微弱运动；2分，后肢可运动，但无法站立或跳跃；3分，可站立或跳跃，但有明显共济失调；4分，后肢运动功能完全恢复.

1.5组织病理学观察神经功能评分完毕后，用戊巴比妥钠30 mg・kg-1麻醉动物后，以40 g・L-1多聚甲醛经心灌注固定脊髓组织，取腰段脊髓组织（L57），行石腊包埋后切片（6 μm厚），HE染色，光镜下（400×）由一不了解分组情况的观察者观察脊髓病理学改变并对脊髓前角正常运动神经元计数. 损伤及坏死神经元表现为胞核固缩或溶解，胞质呈嗜伊红染色，胞质中尼氏体消失；正常神经元表现为多角形结构，胞核结构清晰，胞质中尼氏体存在. 病理损伤程度通过计数脊髓前角 (沿中央导水管横线以前)正常神经元数来评估. 每只动物脊髓前角正常神经元计数为 3张切片计数的均数.

统计处理： 所有生理学参数以x±s表示，组间比较采用随机单位组方差分析；神经功能评分和脊髓前角正常神经细胞计数各组间比较采用非参数的秩和检验（KruskalWallis test）, 再用 Mannwhitney U检验进行比较，显著性水准用比较次数校正. 神经功能评分及脊髓前角正常神经元数之间的相关性分析采用Spearman等级相关分析.

2结果

2.1生理学参数各生理学参数各时间点组间无明显差异(P>0.05, Tab 1).

2.2神经功能评分H组的神经功能评分明显高于C组、D+H组及D组(P<0.01)；C组、D+H组及D组的神经功能评分组间无明显差异(P>0.05, Fig 1).

2.3组织病理学观察H组的脊髓前角正常神经细胞数明显高于C组、D+H组及D组(P<0.05)；C组、D+H组及D组的脊髓前角正常神经细胞数组间无明显差异(P>0.05, Fig 2). C组、D+H组形态几乎未见到前角运动神经细胞，脊髓损伤严重，有大量的空泡变性（Fig 3A, C）. H组可观察到形态基本正常的前角运动神经细胞，结构完整，核仁清晰，可见尼氏体（Fig 3B）.

2.4神经功能评分与脊髓前角正常神经细胞数之间的相关性再灌注48 h后神经功能评分与其对应脊髓前角正常神经细胞计数之间有显著相关（r=0.804, P<0.01）.

表1生理学参数的变化　(略)

图1再灌注48 h神经功能评分　(略)

3讨论

本实验表明，高氧液预处理能够明显提高兔脊髓缺血后的神经功能学评分和改善病理组织学损伤. 如果高氧液预处理前给予氧自由基清除剂DMTU，则完全取消高氧液预处理的保护作用，仅仅单独给予氧自由基清除剂对脊髓缺血损伤不产生影响. 上述的结果证明高氧液预处理对脊髓缺血再灌注损伤有保护作用，而且氧自由基可能参与了这种保护作用.

图2再灌注48 h时脊髓前角正常神经元计数　(略)

缺血预处理是机体对于缺血再灌注损伤的一种内源性保护现象，Matsuyama等［3］首次报道缺血预处理对脊髓缺血损伤有显著的保护作用，随后, 其他的学者也证实了这一点［4，5］. 虽然缺血预处理的临床直接应用价值有限，但对其机制的研究为药物模拟缺血预处理提供了新的途径. 目前关于缺血预处理的保护机制尚未完全阐明，有很多证据显示氧自由基参与缺血预处理的保护作用, Ohtsuki等［8］认为脑缺血预处理的保护机制是由于氧自由基生成增多触发了体内热休克蛋白及SOD（超氧化物歧化酶）的合成增加. Rauca等［9］证实自由基参与脑缺氧预处理的保护. Pain等［10］认为心肌缺血预处理的保护机制是由于预缺血期间产生的氧自由基触发蛋白激酶的激活.

图3兔脊髓病理切片　(略)

高氧液中氧分压达到90～100 kPa并含微量臭氧. 臭氧在常温下是氧化性很强的气体，进入机体后，能产生活性很强的自由基［11］. 高氧液中臭氧浓度低于20 mg・L-1，此浓度临床使用，安全性高［12］. 治疗剂量的臭氧预处理能增加大鼠肝脏抗缺血再灌注损伤的能力［13］. 此次实验证实高氧液预处理对兔脊髓缺血再灌注损伤有明显的保护作用，表明高氧液预处理能够调动了机体内源性保护机制，增强机体对缺血、缺氧的耐受性，其机制可能是由于高氧液中所含张力较高的氧气(90~100 kPa)及安全浓度范围内的臭氧预处理兔后，使机体自由基增加，达到了模似缺血预处理的效果，从而对兔脊髓缺血再灌注损伤产生保护作用.

DMTU是一种强有力的自由基清除剂 , 其血浆半衰期可达 25~34 h，能清除多种自由基及脂质过氧化物［14］. 本研究所选取的DMTU剂量 (500 mg・kg-1)系参照以往研究结果， 研究证实此剂量 的DMTU给予兔后，其血药浓度可有效清除体内自由基产生［14］. 兔脊髓缺血再灌注损伤后，其后肢运动功能的恢复程度受多种因素的影响，如：温度、血压及血气等，本实验中，这些因素在两组兔中无统计学差异，因此可以排除这些因素的影响. 高氧液预处理作为一种简易方便、安全有效的方法在临床上可能将有较高的应用价值，但对其作用机制还有待进一步深入研究.

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