基于SRAP和IRAP标记的野生君迁子居群取样策略分析

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摘要：君迁子（Diospyros lotus L.）是中国栽培柿（D. kaki Thunb.）的主要砧木，其适应性和繁殖能力强，表型变异丰富，存在多个变种和近缘种，在国内广泛分布。目前，有关君迁子居群的取样策略尚不完全清楚。试验以1个野生君迁子自然居群（40个单株）和8个外类群种质为试材，利用SRAP和IRAP标记技术分析其居群取样策略。结果表明，20对SRAP引物扩增出188条谱带，多态性比例为94.68%；9条IRAP引物共扩增出102条谱带，多态性比率为95.10%。UPGMA聚类分析表明，君迁子居群分别与柿和浙江柿（D. glaucifolia L.）独立成组。供试君迁子居群遗传多样性信息参数随取样梯度的增加（5～35个单株）而增加。Nei’s基因多样性指数（H）在取样梯度为20个单株时达到总体的95%以上，Shannon信息指数（I）和多态性位点百分率（PPL）在取样梯度为25个单株时分别达到总体的95%以上，随着取样梯度的进一步增加，Nei’s基因多样性指数、Shannon信息指数和多态性位点百分率数值趋稳。综上所述，基于遗传多样性信息参数（H、I、PPL）的居群取样单株数量建议为20～25个单株。

关键词：君迁子（Diospyros lotus L.）；分子标记；居群取样策略；砧木

中图分类号：S665.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2838-05

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.031

君迁子（Diospyros lotus L.；2n=2x=30）是柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros L.）植物中除栽培柿（D. kaki Thunb.）外的重要果树，别名黑枣、软枣、高加索柿等，是柿重要的砧木资源[1，2]。君迁子适应性和繁殖能力强，分布范围广，表型变异丰富[3]，存在多个变种和近缘种[4]，与富有（D. kaki cv. Fuyuu）系甜柿品种嫁接的亲和性表现复杂[5，6]。有效保护和利用柿习用砧木君迁子及其所蕴藏的丰富遗传资源对柿产业的可持续发展具有重要意义。野生种质资源的调查和采集受到人力和物力的限制，通常不能对某个居群的所有个体或某个物种的所有居群都进行采集或保护，只能采集或保护其中的一部分，然而人们又希望获得尽可能多的遗传变异以代表居群或物种的整体遗传多样性水平。因此，开展对野生种质资源遗传多样性调查、保护和利用的研究，首先考虑的问题便是最佳的居群取样策略。遗传多样性的取样策略是指对一定地理分布范围内的生物个体取样时，使样本具有代表性和包含尽可能多的遗传变异信息的最佳取样方法[7]；它在很大程度上受到生物自身特性、生长环境和取样目的的影响。试验以一个野生君迁子居群的40份单株和华中农业大学柿圃活体保存的7份柿品种及1份浙江柿（D. glaucifolia L.）种质为试材，基于srap（Sequence-related Amplified Polymorphism）和irap（Inter-retrotransposon Amplified Polymorphism）标记技术分析君迁子居群的最佳取样策略，以期为国内野生君迁子种质野外科学采集、生物多样性保护的研究提供工作基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料共48份，其中40份单株采自位于大别山东部的安徽省六安市金寨县天堂寨镇马石村（北纬31.1885°-31.1889°；东经115.7691°-115.7695°；海拔为600～710 m）的一个君迁子自然居群；采用简单随机取样方式进行居群内单株取样。富有、松本早生（Matsumoto-wase fuyuu）、上西早生（Uenishi-wase）、次郎（Jirou）、前川次郎（Maekawa-jirou）、阳丰（Youhou）和罗田甜柿（Luotian Tianshi）7份栽培柿（2n=6x=90）品种及1份浙江柿（2n=2x=30）种质均采自华中农业大学柿圃（北纬30.4772°，东经14.3603°，海拔为30 m）。

1.2 DNA提取

利用CTAB法[8]提取幼嫩叶片基因组DNA；采用Nano Drop 2000超微量分光光度计和琼脂糖电泳检测DNA质量。

1.3 SRAP标记扩增

SRAP扩增参考Guo等[9]研究结果，采用20 μL PCR反应体系，含1×Buffer，2.5 mmol/L Mg2+，正向和反向引物各300 nmol/L，200 μmol/L dNTPs，50 ng模板DNA，1 U Taq酶。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃、1 min，35 ℃、1 min，72 ℃、1 min，5个循环；94 ℃、1 min， 50 ℃、1 min，72 ℃、2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。共筛选到20对多态性较好的引物组合，序列信息见表1；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 IRAP标记扩增

IRAP扩增参考Du等[10]的方法，采用20 μL PCR反应体系，反应体系含1×Buffer，2.0 mmol/L Mg2+，正向和反向引物各400 nmol/L，250 μmol/L dNTPs，50 ng模板DNA，1 U Taq酶。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃、1 min，50 ℃、1 min， 72 ℃、1 min，35个循环；72 ℃ 延伸6 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，所用9条引物及序列信息见文献[10]，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 数据统计与分析

试验得到的图谱清晰、重复性强的电泳条带用0/1矩阵统计；采用NTSYS-pc version 2.10[11]统计分析软件计算材料间的Dice相似指数，并利用UPGMA法（Unweighted Pair Group Method Arithmetic Averages）进行聚类分析；运用Microsoft Office Excel 2010软件处理试验所得数据并作图，从君迁子居群总体（40个单株）中模拟抽取5、10、15、20、25、30、35等7个不同取样梯度的样本，各取样梯度重复抽取10次；采用POPGENE1.32[12]分析软件计算不同抽样梯度下的观测等位基因数（Number of allele， Na）、有效等位基因数（Effective number of allele，Ne）、Nei’s基因多样性指数（Nei’s gene diversity index，H）、Shannon信息指数（Shannon’s information index，I）和多态性位点百分率（Polymorphic loci，PPL）等遗传多样性信息。

2 结果与分析

2.1 SRAP和IRAP标记的多态性分析

分别从已发表的SRAP和IRAP引物序列信息中筛选出已得到较好扩增结果的20对和9条引物，其扩增谱带大小均在200～2 000 bp。将SRAP和IRAP标记的多态性信息含量进行比较，结果见表2。从表2可见，SRAP和IRAP分别扩增出188条和102条谱带，其中多态性谱带分别为178条和97条，多态性比例分别为94.68%和95.10%。IRAP的平均扩增谱带数（11.33）和平均多态性谱带数（10.78）略高于SRAP（分别是9.40、8.90）；但是，有效多重系数、多态性信息含量和标记指数则是SRAP（分别是3.71、0.31、1.15）高于IRAP（分别是2.02、0.27、0.55）；同时，SRAP和IRAP结合的标记指数（1.72）均高于SRAP和IRAP各自独立的标记指数。

2.2 SRAP和IRAP标记的聚类分析

基于SRAP和IRAP分析数据，计算出48份柿属种质的Dice相似系数，结合2种分子标记获得的UPGMA聚类结果见图1。从图1可见，40份野生君迁子居群单株间遗传变异丰富并单独聚类成组，与7份柿品种和1份浙江柿种质独立分开，说明SRAP和IRAP数据结合分析具有较高的可靠性，因此可用于进一步的君迁子居群取样策略分析。

2.3 SRAP和IRAP标记的居群取样策略分析

基于SRAP和IRAP标记、利用POPGENE1.32软件分析野生君迁子居群的遗传变异情况，结果见表3。从表3可见，基于SRAP和IRAP标记均能检测到较高的居群遗传多样性，但SRAP的多态性位点百分率（88.51%）、观测等位基因数（1.89±0.33）、有效等位基因数（1.57±0.36）、Nei’s基因多样性指数（0.32±0.18）和Shannon信息指数（0.47±0.24）均高于IRAP（分别是85.26%、1.85±0.36、1.49±0.33、0.29±0.17、0.44±0.23），而采用SRAP和IRAP数据结合分析的居群遗传多样性介于SRAP和IRAP上述参数之间（分别是87.36%、1.87±0.33、1.54±0.35、0.31±0.18、0.46±0.24）。

对不同单株取样量前提下大别山野生君迁子居群的SRAP和IRAP遗传多样性信息参数分7个取样梯度进行统计，结果见表4。从表4可见，当取样量为5株时，君迁子居群的遗传多样性信息参数最低；当取样量为35株时，君迁子居群的遗传多样性信息参数最高；随着单株取样量的增加，君迁子居群的各项遗传多样性信息参数均呈逐渐增大的趋势。

采用Nei’s基因多样性指数（H）、Shannon信息指数（I）和多态性位点百分率（PPL）3项遗传多样性信息指标分析君迁子居群的取样策略，结果见图2。从图2可见，H、I和PPL均随着取样梯度的增加（从5株到35株）而增加；当取样量为20株时，H达到总体（40株）的96.23%（超过95%），I和PPL达到总体的92.05%和94.08%；当取样量为25株时，I和PPL分别达到总体的96.75%和95.32%（均超过95%）；当遗传多样性信息参数超过总体95%后，H、I和PPL这3项遗传多样性信息参数的数值趋稳。3项遗传多样性信息参数均随着取样量的增加而增加，但不同遗传多样性信息参数随样本量增加而增幅不同，这说明随机选取20～25个单株就能代表和反映一个居群的整体遗传特性（达到样本总体遗传多样性信息参数的95%以上）。

3 讨论

君迁子是中国柿栽培主要的砧木，全国有17个省（市、自治区）具有分布，绝大部分种质资源处于野生或半野生状态，主要生于海拔500～2 300 m左右的山地、山坡、山谷灌丛中，在北方地区仅有少量栽培[1，2，4]。在柿的分类上，完全甜柿（Pollination Constant Non-astringent，PCNA）在树上就能自然脱涩、去皮即可脆食，其无需人工脱涩和良好口感等商品价值相对于非完全甜柿（Non-PCNA）更具备市场竞争优势[13]，已在云南、福建、山西、湖北等省初具产业规模。现在生产上综合性状表现良好的完全甜柿品种如富有、太秋（Taishu）等与习用砧木君迁子嫁接表现出早期不亲和或后期不亲和，尤其是结果太多时树势易速衰[5，14]，且新育成的早秋（Soshu）、甘秋（Kanshu）等品种或多或少具有富有系遗传背景。而国内君迁子分布范围广、变异类型丰富，推测与富有系嫁接广亲和的君迁子砧必然存在；基于形态、生理、解剖和分子水平的研究，国家柿种质资源圃（陕西杨凌）尚存20年生的君迁子与富有嫁接亲和性及生长势同本砧差异不显著（西北农林科技大学，数据未发表）的事例。因此，开展君迁子收集、保存和评价工作，筛选出与主栽甜柿品种嫁接亲和度高、适应性强且早实丰产的配套优良砧木将对国内甜柿产业可持续发展具有重要意义。

金燕等[15]对野生大豆居群的研究表明，随机取样量应保持在35～45株时方能代表居群整体并反映居群的整体遗传特性。刘文献等[16]对华山新麦草2个居群的6、10、14、18、22、26、30等7个单株取样梯度进行研究表明，当样本量为18时，包含了居群95%以上的变异。课题组利用SRAP和IRAP分子标记对生长于大别山东部的一个野生君迁子居群分单株进行取样策略研究，结果表明在各取样梯度上的观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性指数（H）、Shannon信息指数（I）和多态性位点百分率（PPL）均存在随样本量的增加而随之变大的趋势。为了更准确地说明居群取样量与遗传多样性信息参数之间的关系，采用H、I和PPL这3种遗传多样性信息参数作为评判标准，当君迁子居群取样量为20株时，基于H的遗传多样性信息参数就包含了居群总体95%以上的遗传变异；而当取样量为25株时，基于I和PPL的遗传多样性信息参数方能达到居群总体95%以上的遗传变异；随着取样量的进一步增加各项遗传多样性信息参数（H、I和PPL）的变化基本趋于一致。说明对君迁子居群进行野外考察收集、保护及多样性研究过程中，按照野生取样原则，选取20～25个单株就能代表和反映一个君迁子居群的整体遗传特性。

综上所述，供试君迁子遗传多样性丰富，基于遗传多样性信息参数（H、I、PPL）的居群单株取样数建议设为20～25株。基于以上君迁子取样策略的研究，结合柿属植物已经开发的分子标记[9，10]和居群遗传分析水平，有望在挖掘君迁子新类型以及合理利用与保护野生君迁子种质方面获得更多的理论依据。

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