在线二维柱切换高效液相色谱法同时测定婴幼儿强化奶粉中维生素A、D3和E的含量

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摘要：使用双梯度液相色谱系统紫外检测器，建立了二维液相色谱法全自动、快速、同时测定婴幼儿奶粉中维生素A，D3，E的含量。采用了非水反相系统，以Acclaim C18柱为一维分析柱，Acclaim PAⅡC18柱为二维分析柱。利用一维色谱柱完成维生素A和E的分离测定和维生素D的净化分离；利用二维色谱柱完成维生素D的分析。一维分析以乙腈甲醇体系作为流动相，流速0.6 mLmin；二维分析以乙腈异丙醇体系作为流动相，流速0.8 mLmin，梯度洗脱。检测波长为325， 296和263 nm，采用波长切换方式，整个分析过程仅需28 min。维生素D3在 20～2000 L范围内的相关系数r为0.9998，平均回收率为100.7%；维生素A在1.71～855 mgL浓度范围内的相关系数r为0.9979，平均回收率为114%；维生素E在 4.12～1030 mgL范围内的相关系数r为0.9995，平均回收率为94.0%。本方法可快速准确测定婴幼儿乳品中维生素A、D3和E的含量。

关键词：高效液相色谱； 二维色谱柱； 双样充系统；婴幼儿配方奶粉；维生素D； 维生素A； 维生素E

1引言

婴幼儿配方奶粉又称为母乳化奶粉，是一种以牛乳（或其它动物乳）为主要原料，通过调整成分模拟母乳，可供婴幼儿生长和发育所需要的一种人工食品[1]。根据国家标准中有关奶粉营养成分规定，维生素指标中必须强化的包括维生素A、维生素D和维生素E及其它水溶性维生素等；其中维生素D在实际母乳中含量极低，约为4～40 IU（国际单位）L（0.1-1.0L）[2～4]，主要对应形式为维生素D3和25OH 维生素D3[4，5]，因此通常将维生素D3制成水可分散性的微粒形式，添加到婴幼儿强化奶粉中[5，6]。关于奶粉中维生素A、D和E的测定方法的报道较多，其中高效液相色谱法是常用的分析方法。由于样品基质复杂，3种维生素对温度、光照、氧气和极端的pH值较敏感，且多数经过包被后再添加到食品基质中[7]，因此分析方法常包括皂化破壁、有机溶剂萃取，浓缩和净化等步骤[8，9]，在现行标准分析方法中[9]， 需采用正相制备色谱、反相分析色谱两套仪器，分别进行净化制备和分析，前处理过程极其繁琐，大大影响样品分析效率。本研究采用在线二维柱切换高效液相色谱紫外检测法，样品经过皂化、萃取后，直接进样，同时完成维生素A， D和E的分析测定，提高了方法的准确性和样品分析效率。

2实验部分

2.1仪器与试剂

3结果与讨论

3.1二维色谱流路构建和阀切换时间的确定

维生素A和E在配方奶粉中含量较高，样品经过皂化萃取后，可直接在一维色谱柱中实现分离。维生素D含量较低，且样品基质干扰较大，原标准方法需经过正相制备色谱的净化，将含有维生素D的馏分蒸干定容后，再在反相色谱上进行分析[9]。本研究采用二维色谱分离的中心切割法，样品在一维色谱柱实现初步分离后，将含有维生素D的馏分切割至二维色谱柱中进行分离。系统连接图见图1。

为确定右侧阀的准确切换时间，实验将一维色谱柱直接与UV连接，进标准品溶液，测定维生素D2的出峰时间和维生素d3完全洗脱出色谱柱的时间。由于外界因素影响，维生素D的保留时间会有微小波动，切割的时间窗太窄容易造成目标物的损失；时间窗太宽，会使切换到二维分离柱的溶剂体积过大，对二维分离产生溶剂效应。本实验通过连续进样，考察了保留时间波动范围，确定了最终的切换时间。在一维色谱分离中，维生素A和E在12 min内即可完成分离过程，而在二维色谱分离中维生素D的保留时间约为21～22 min，因此方法采用二位置六通阀实现了色谱柱后的紫外检测器共用。左侧阀的切换时间定在12 min，在12 min之前，一维色谱柱与检测器连接；在12 min之后，二维色谱柱与检测器连接，从而实现维生素A、D和E的同时检测。阀切换时间见表2。

3.2色谱分离条件选择

在色谱分离模式选择上，文献[10]采用正相色谱或反相色谱法进行分析。反相色谱法的优势是可以将维生素D2、D3以及维生素D前体和非活性的异构体分开，因此可以选择维生素D2作为内标，以补偿在前处理过程中维生素D3的损失，提高测定结果的准确性和可靠性[10]。另外，考虑到流动相的兼容性，本实验在一维色谱和二维色谱分离中均采用反相色谱法。