益智药材中圆柚酮含量的高效液相色谱法测定

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作者：李兴华，胡昌江，李文兵，黄勤挽，谢秀琼

【摘要】 目的建立益智药材中圆柚酮的含量测定方法，并对不同产地药材进行含量测定。方法采用高效液相色谱法，色谱柱为diamonsil?c18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流动相为乙腈?水(65∶35)，检测波长为235 nm，流速为1.00 ml·min?1，柱温为40℃。结果圆柚酮在0.115 2～0.268 8μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 9；平均回收率为97.34%，rsd=1.48%（n=6）。不同产地益智药材中圆柚酮的含量在1.50～2.10 mg·g?1之间。结论该法可靠、准确、简便，可作为益智药材的质量控制方法。

【关键词】 益智； 圆柚酮

chinaabstract：objectiveto establish a method for determination of the content of nootkatone in fructus alpinia oxyphyllae，and to determine the content of nootkatone in fructus alpinia oxyphyllae from different places by this new method.methodsthe diamonsil?c18(5 μm，250 mm×4.6 mm) column was used. the mobile phase was ch3cn?h2o(65:35) and the detection wavelength was set at 235 nm.the flow rate was 1.00 ml·min-1 and the column temperature was 40℃. resultsthe nootkatone content showed a good linear relationship within the range of 0.115 2～0.268 8μg(r=0.999 9).the average recovery was 97.34% and rsd was 1.48%（n=6）. the content of nootkatone in fructus alpinia oxyphyllae from different places was within the range of 1.50～2.10 mg·g-1.conclusionthe method is simple and the result was reliable. it can be used for the quality control of this herbal medicine.

key words： fructus alpinia oxyphyllae； nootkatone

中药益智，为姜科植物益智alpinia oxyphylla miq.的干燥成熟果实，主产于我国的海南和广东，为四大南药之一。其功效为温脾止泻，摄唾涎，暖肾，固精缩尿，主治脾寒泄泻，腹中冷痛，口多涎唾，肾虚遗尿，小便频数，遗精白浊［1］。我们的前期研究发现，益智石油醚提取部位为其缩尿作用的有效部位，并且通过气相色谱?质谱联用分析，发现此部位中的主要化学成分为圆柚酮（nootkatone）［2］。国外已有研究报道，从益智药材中分离得到的圆柚酮，在抗实验性胃溃疡、抑制脂多糖活化巨噬细胞中no的产生和抑制由抗原引发的rbl?2h3细胞的脱落等方面具有显著的活性，为益智药材的有效成分之一［3］。而对于益智药材中圆柚酮的含量情况还未见相关报道。为了更好地控制药材质量，我们采用高效液相色谱法建立了益智药材中圆柚酮的含量测定方法，并测定不同产地药材中圆柚酮的含量。

1 仪器与试药

agilent 1100高效液相色谱仪，hpchemstation 6.04软件包（美国agilent公司）；赛多利斯bp211dag电子天平（德国sartorius公司）；超声波清洗器cx?100（北京医疗设备二厂）。圆柚酮对照品由美国sigma公司提供(批号：10112423，纯度>98%)。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。不同产地的药材由成都中医药大学谢秀琼教授从各产地收集，并经成都中医药大学卢先明教授鉴定为姜科植物益智alpinia oxyphylla miq.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为diamonsil?c18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相为乙腈?水(65∶35)；检测波长为235 nm；流速为1.00 ml·min-1；柱温为40℃。灵敏度为0.005aufs。在选定条件下，圆柚酮与样品中其他色谱峰达基线分离，其理论塔板数(n)大于4 000。对照品溶液和供试品溶液色谱图见图1～2。

2.2 对照品溶液的制备

取圆柚酮对照品适量，精密称定，置25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成含圆柚酮0.480 0 mg·ml-1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取益智药材，除去杂质及外壳，粉碎，过40目筛。取粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 ml，称定重量，超声提取（360 w，35 khz）30 min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取圆柚酮对照品溶液(0.480 0 mg·ml-1) 0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 ml，分别置25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样10 μl测定峰面积。以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，则回归方程为：a=3 237.2c +4.33，r=0.999 9。表明圆柚酮在0.115 2～0.268 8 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取上述对照品溶液10 μl，重复进样5次，峰面积rsd=0.20%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性实验

取同一批样品（海南省琼中县出产）5份，分别按供试品溶液的制备方法制备，进样10 μl，测定峰面积，计算含量。其rsd=1.23%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性实验

取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h进样10 μl，测定峰面积，计算含量。其rsd=0.32%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.8 加样回收率实验

取6份已知含量的样品（海南省琼中县出产，含量为2.10 mg·g-1）约0.1 g，精密称定，分别加入圆柚酮对照品溶液(0.480 0mg·ml-1) 0.5 ml。按供试品溶液的制备方法制备，进样10 μl，测定峰面积，计算回收率。结果见表1，平均回收率为97.34%，rsd=1.48%。表1 加样回收率实验结果 （略）

2.9 样品的含量测定取不同产地的益智药材,用本实验方法测定。结果见表2。表2 不同产地益智药材中圆柚酮含量测量结果（略）

3 讨论

圆柚酮(nootkatone)又称诺卡酮，是属于雅槛蓝烷(eremophilane)系的双环倍半萜酮。其甲醇溶液在200～400 nm波长下扫描，结果在235 nm波长处存在最大吸收峰，故选择235 nm作为检测波长。

益智从《中国药典》1963版ⅰ部即开始收载，现行版《中国药典》的含量测定项下只要求本品种子含挥发油不得少于1.0%（ml·g-1），对于其中指标性成分的含量限度暂无规定。本文建立了益智药材中圆柚酮的高效液相色谱含量测定方法，并对不同产地药材样品进行含量测定，结果重复性好、精密度高、操作简便，效果满意，可作为益智药材的质量控制方法，也可为益智药材的栽培及收购等提供参考。

【参考文献】

1］国家药典委员会编.中国药典，ⅰ部［s］.北京：化学工业出版社，2005：204.

［2］黄勤挽，胡昌江，李兴迎，等.益智仁盐炙前后挥发油成分对比研究［j］.中国药业，2008，17(5)：3.

［3］morikawa t，matsuda h，toguchida i，et al.absolute stereostructures of three new sesquiterpenes from the fruit of alpinia oxyphylla with inhibitory effects on nitric oxide production and degranulation in rbl?2h3 cells［j］.j nat prod，2002，65(10)：1468.