甘草活性成分抗呼吸道合胞病毒作用
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【关键词】 甘草；呼吸道合胞病毒；抗病毒作用
【摘要】 目的 研究甘草抗病毒活性成分(gx)体外抗呼吸道合胞病毒(rsv)的作用。方法 采用中性红实验和观察细胞病变(cpe)法，以利巴韦林为阳性药,测定gx对rsv的抑制作用。结果 gx的半数中毒浓度（tc50）为460.00?μg/ml，半数有效抑制浓度(ec50)为23.53?μg/ml，治疗指数(ti)为19.55;gx在rsv感染hela细胞2，4，6，8，10?h后给药, 对rsv复制均有明显的抑制作用(p<0.01)；且gx对rsv有中和作用。结论 gx在体外对rsv复制有明显的抑制作用。
【关键词】 甘草；呼吸道合胞病毒；抗病毒作用
呼吸道合胞病毒（rsv）是一个世界范围内婴幼儿最常见的呼吸道感染的病原体。目前，对rsv的防治仍无有效的疫苗和药物〔1〕。近年来，国内外有关抗病毒中药的研究日益增多，从中筛选其有效成分已成为当前抗病毒新药开发的一个热点〔2〕。本课题组在2004年报道甘草水提液具有明显的抗rsv的作用；在2005年发现甘草有效部位gc3?1?4具有抗rsv的作用基础上〔3〕,进一步分离到抗病毒活性成分（gx），并在细胞水平上检测其抗rsv的作用。现将结果报告如下。
1 对象与方法
1?1 材料
甘草(产地内蒙古，经黑龙江省药品检验中药研究所鉴定)。利巴韦林注射液(天津药业集团新郑股份有限公司,批号：0610152)。人宫颈癌传代细胞(hela),(中国疾病预防控制中心病毒研究所)。呼吸道合胞病毒(rsv-long株)(中国疾病预防控制中心病毒研究所)。rsv在hela细胞中的组织半数感染量(tcid50)为1×10-6.6/0.2?ml。本次实验采用100tcid50/0.2?ml的感染量。硅胶制备板(安徽良臣硅源材料厂)。甲醇、三氯甲烷、无水乙醇等，均为分析纯(天津市博迪化工有限公司)。中性红(上海华舜生物工程有限公司)，用磷酸盐缓冲液稀释。脱色液：由无水乙醇、枸橼酸钠和盐酸组成。
1?2 方法
1?2?1 甘草抗病毒活性成分（gx）的制备
甘草经水煎煮浸提、醇沉、大孔吸附树脂柱层析得到的gc3?1?4,再经由氯仿和甲醇组成的展开剂，在硅胶板上经薄层层析得gx。
1?2?2 药物毒性实验
用细胞维持液将gx和利巴韦林释为7个浓度组，分别加入到hela细胞已长成单层的96孔培养板上。同时设正常细胞对照组。置35℃、5% co2培养箱培养3?d后，弃去维持液,每孔添加0.2?ml中性红染液,放回培养箱培养2?h。取出后用磷酸盐缓冲液(pbs)洗2次,添加0.2?ml脱色液。室温暗处放置30?min后,酶标仪450?nm波长下测吸光度(a)值〔4〕，测定细胞存活率，求药物半数中毒浓度(tc50)。细胞存活率=药物组平均a值/细胞对照组平均a值×100%。
1?2?3 药物抗rsv实验
参照文献〔5〕。实验分3组进行。(1)药物的抑制作用：在96孔板上，接种100tcid50/0.2?ml rsv液，0.2?ml/孔。吸附2?h后，分别加入不同浓度的gx和利巴韦林。置培养箱中培养。同时设正常细胞对照组和病毒对照组，待病毒对照组细胞病变(cpe)为4时，中性红实验同上,测定病毒抑制率，求药物的半数有效浓度(ec50)和治疗指数(ti)。病毒抑制率=［实验组(药物+病毒)平均a值-病毒对照组平均a值］/［正常细胞对照组平均a值-病毒对照组平均a值］×100%。cpe记录规则：0为细胞无cpe；1为0～25% cpe；2为25%～50% cpe；3为50%～75% cpe；4为75%～100% cpe。ti=tc50/ec50。(2)不同时间给药对rsv抑制作用：向96孔板中，加入100tcid50/0.2?ml rsv液，0.2?ml/孔，分别作用2，4，6，8，10，12?h后吸弃病毒液，再分别加入gx（浓度为120.00?μg/ml）和利巴韦林（浓度为80.00?μg/ml），培养方法同上。待病毒对照组cpe为4时，记录cpe结果。(3)药物的中和作用：200tcid50/0.2?ml rsv液与含不同浓度药物的维持液等体积混合，35℃作用2?h后,加到96孔板中，0.2?ml/孔。吸附2?h，弃上清，加细胞维持液，置培养箱中培养。待病毒对照组cpe为4时，记录cpe结果。
1?3 统计分析
采用sas?8?2软件进行分析。利用reed?muench法测定病毒tcid50，logit回归计算药物tc50和ec50〔6〕。不同时间处理组或不同剂量组与病毒对照组之间的结果比较采用kruskal-wallis法。
2 结 果
2?1 药物毒性结果测定
根据中性红实验测定细胞存活率，logit回归计算得gx的tc50为460.00?μg/ml，利巴韦林的tc50为1.01?mg/ml。
2?2 药物对细胞内rsv抑制作用(表1) 表1 gx和利巴韦林对rsv的抑制作用gx浓度(略)
经logit回归方法计算得gx的ec50为23.53?μg/ml，利巴韦林的ec50为12.90?μg/ml。所以gx的ti为19.55，利巴韦林的ti为78.29；gx在一定浓度时对rsv在hela细胞内的复制有明显的抑制作用。
2?3 不同时间给药对rsv抑制作用
kruskal-wallis检验结果表明，在rsv感染2，4，6，8，10?h后给药，gx和利巴韦林组细胞病变(cpe)程度均低于病毒对照组，且差异有统计学意义(p<0?01)，说明在rsv感染2，4，6，8，10?h后给药，gx仍具有抑制rsv在hela细胞内复制的作用。
2?4 药物对rsv的中和作用(表2)表2 gx和利巴韦林对rsv中和作用（略）注：* p<0.01
gx15?55?μg/ml及以上各药物浓度组cpe程度均低于病毒对照组cpe,差异有统计学意义(p<0?01)；利巴韦林10?37?μg/ml及以上各药物浓度组cpe程度也低于病毒对照组cpe，差异也有统计学意义(p<0?01)。说明gx在一定浓度时，对病毒有较好的直接灭活作用。
3 讨 论
本实验用抗病毒活性作为导向分离方法从甘草中分离到抗病毒成分gx。为了验证gx抗rsv的作用，实验中rsv病毒感染量定为100tcid50/0?2?ml，并设立了严格对照组(正常细胞对照，病毒对照和阳性药物对照)。结果表明gx对rsv复制有明显的抑制效果，其ec50为23?53?μg/ml，ti为19?55。结果也表明，gx抗rsv作用是多途径的，不仅有直接灭活病毒的作用，而且对于进入细胞的病毒，无论是在病毒复制的早期，还是在病毒复制的中晚期，均有一定的抑制作用。
目前，大多数研究认为甘草中有抗病毒作用的主要成分是甘草酸〔7〕和甘草多糖〔8〕。实验中，初步验证gx不是甘草酸和甘草多糖，可能是一种新的抗病毒物质，因此，应对gx化学结构进行深入研究。体外研究不能充分体现药物在体内的生化转化效应,本实验有待于在动物体内检验其抗rsv的作用；gx是通过抑制病毒核酸复制,还是通过阻止病毒蛋白合成，而实现对rsv复制的抑制，其具体作用机制尚需研究。
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