正交试验优选延胡索提取工艺
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【摘要】 目的：优选延胡索最佳提取工艺。方法：采用正交试验法，以延胡索提取的浸膏得率和延胡索乙素提取率为考察指标，利用HPLC法测定延胡索乙素的含量。结果：最佳提取工艺为延胡索粉加6倍量80%的乙醉回流提取3次，每次2h。结论：优选得到的工艺简便易行，稳定性好。
Optimization of Extraction Process of Rhizoma Corydalis with Orthogonal Design Method
【Abstract】 Obijective:To optimize the best extraction process of Rhizoma Corydalis.
Method:Using orthogonal design method, to apply extract yield of Rhizoma Corydalis and the extract amount of Trahydropalmetine as observing indexes, to measure the content of Trahydropalmetine with HPLC.Result:The optimum extraction process was as follows, adding 6 times of 80% alcohol into Corydalis meal, refluxing and extraction for 3 times, two hours every time. Conclusion: This optimized process is simple, stable and efficient.
【Key words】 Rhizoma Corydalis; Trahydropalmetina; Extraction process; Orthogonal design
延胡索为常用中药，其主要有效成分是以延胡素索乙素为代表的生物碱，其中药制剂一般使用酸水提取或一定浓度的乙醇提取[1-2]。但据有关报道[3]，延胡索中的生物碱在水提过程中因长时间受热会部分分解，为尽量减少延胡索有效成分的损失，采用正交设计方法，以不同浓度的乙醇为溶剂采取回流提取，以延胡索提取的收膏率和延胡素乙素提取量[4]为考察指标，优选延胡素的最佳提取工艺，为实际生产提供参考。
1 仪器及试药
1.1 仪器 美国Waters600-2996高效液相色谱仪（PDA紫外检测器，EMPOWER化学工作站）；KQ-100A型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；E12140 万分之一电子天平（OHAC）；320-SdeltaPH计（梅特勒一托利多）。
1.2 药品与试剂 延胡素乙素对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）：实验药材来自钟祥市人民医院药房，经鉴定符合2005年版药典。甲醇、乙腈，色谱纯。乙醇、乙醚，分析纯，双蒸水为自制，其他试剂为分析纯。
2 测定条件及方法
2.1 色谱条件 参照中国药曲2005版一部[5]选用色谱柱：Agilent HC―C18(250mm X 4.6mm，5um):流动相：甲醇―0.1%磷酸（用三乙胺调pH至6.0）（38:62）：检测波长：280mm: 柱温:30℃流速：1ml/min: 进样量:10ul,延胡索乙素与其它组分达到基线分离.分离度不低于2.0.理论塔板数以延胡索乙素峰面积计算不低于3000。
2.2 对照品溶液及阴性对照品溶液的制备 精密称取延胡索乙素对照品0.0006g，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
2.3 供试品溶液的制备 取延胡索提取所得干浸膏0.2g，精密称定，加甲醇30ml溶解，超声处理30min，用甲醇定容至50ml，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液0.5ml，再用甲醇定容10ml，混匀，取得。
2.4 线性关系的考察 取标准品溶液适量分别配制成12.24.36.48.60ug/ml浓度的溶液，各吸取10ul入色谱仪，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线得回归方程为Y=7.93 x 105X―1.00x103（r=0.9997）结果表明：延胡索乙素在0.12―0.60ug范围内具有良好的线性关系。
3 正交试验设计及结果
3.1 正交试验设计方案 根据所查资料，延胡素中主要有效成分为延胡索乙素，它易溶于氯仿、乙醚，难溶于石油醚，在冷水中也不易溶解，但易溶于热乙醇，几不溶于水或碱性水溶液，我们采用乙醇回流提取的方法，以延胡索乙素含量为评价指标，综合考虑了影响回流提取的几个因素，即乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数，对各个因素设置了三个水平，进行L9（34）正交试验，以确定最佳提取工艺条件。见表1
表1 因素水平表
3.2 试验结果 取延胡索粗粉适量，按表1安排试验，提取液减压回收乙醇，真空干燥至恒重，得干浸膏，称重。按供试品溶液制备方法制备，精密吸取供试品溶液10ul，进样，测定，并计算样品中延胡索的含量。试验结果见表2
表3 醇提部分方差分析表
由表2可知，在本实验考察范围内，有两因素均对实验结果有显著影响，其中B为极显著影响的因素，A为显著影响因素，C、D的影响效果不明显。
根据表3直观分析中极差R的大小，四因素对实验结果影响程度为B＞A＞D＞C。即乙醇浓度影响最大，其次为乙醇用量，最后是提取次数和提取时间。结合各因素K值的大小可知，各因素水平的最佳组合为A1B3C2D3，即方中醇提部分最佳提取工艺为以6倍量，80%乙醇，提取3次，每次2h。
3.3 醇提工艺验证试验 称取延胡索饮片各60g，共3份，分别按选定的最佳工艺条件进行提取，其延胡索乙素含量见表4
表4 最佳醇提工艺验证试验结果
试验结果表明，最佳工艺提取延胡索乙素的平均含量为0.57%左右
4 讨论
4.1 本文HPLC 法中所用流动相是为多次试验摸索而得，可使延胡索乙素与其他成分达到基线分离，峰形及保留时间均合适。
4.2 延胡索乙素遇高温易被破坏，在处理样品全过程中应尽量避免高温。低温时，延胡索乙素较稳定，室温贮藏一段时间后延胡索乙素含量基本保持不变。
4.3 本文确定的延胡索最佳提取工艺，可用于实验生产中参考。
参考文献
[1]黄山，陈峰，郭立玮，延胡索提取工艺的优选，中国中医药信息杂志―2006:13（1）―47-48
[2]张丽筑，朱珠，郝小燕，延胡索生物总碱两种提取方法的比较，贵阳医学院学报―2006:31 （3）―280―282
[3]陈洪燕，万明，孙金霞，均匀设计延胡索提取工艺的研究，湖北中医杂志―2006：28（7）―54―55
[4]程建明，井山林，延胡索中延胡索乙素不同提取方法的比较研究．时珍国医国药―2006：17（7）―1236―1237
[5]国家药典委员会 中华人民共和国药典[S]. 北京：化学工业出版社，2005 .94