高效液相色谱法测定西司他丁钠含量及物质

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【摘要】目的建立HPLC测定西司他丁钠的含量和有关物质。方法采用高效液相法色谱(HPLC法)，以C18柱(4.6mm×250mm，5μm)为分析柱，乙腈∶0.1mol/L磷酸铵(用磷酸调pH至6.8)(30∶70)为流动相，检测波长210nm，流速0.8ml/min，柱温50℃。结果西司他丁钠在0.08～0.60mg/ml范围内与峰面积有良好的线性关系，平均回收率为100.2%(n=9)。西司他丁钠与相邻杂质峰完全分离，西司他丁钠的检测限为1.8ng，定量限为5.9ng。结论该方法可靠、简便、准确。可作为西司他丁钠含量和有关物质的测定方法。

【关键词】西司他丁钠；高效液相色谱法；有关物质

ABSTRACTObjectiveToestablishanHPLCmethodforthedeterminationofthecontentandtherelatedsubstancesofcilastatinsodium.MethodThecolumn:C18(4.6mm×250mm,5μm)wasused,themobilephasewasacetonitrileand0.1mol/Lphosphateammonium(adjusttopH6.8withphosphoricacid)(30∶70),thedetectingwavelengthwas210nm,theflowratewas0.8ml/minandthecolumntemperaturewas50℃.ResultsTheaveragerecoverywas100.2%(n=9).Cilastatinsodiumncouldbecompletelyseparatedfromotherimpurities.Limitofdetectionforcilastatinsodiumwas1.8ng.Limitofquantitationforcilastatinsodiumwas5.9ng.ConclusionTheproposedHPLCmethodisreliable,convenientandaccurate.Themethodcanbeusedfordeterminationofcontentandrelatedsubstacesofcilastatinsodium.

KEYWORDSCilastatinsodium;Relatedsubstaces;HPLC

西司他丁钠(cilastatinsodium，CS)是一种很好的肾去氢肽酶I抑制剂，其本身不具有抗菌活性，对β内酰胺酶也无抑制作用，它是碳青霉烯类药物亚胺培南(imipenen，IMP)的增效剂。IMP单独给药时，经肾小球过滤或分泌后，被近端肾小管上皮细胞刷状缘中的去氢肽酶I水解失活60%～95%，导致尿中活性药物浓度降低。CS能阻抑IMP进入肾小管上皮组织，减少IMP的排泄并保护IMP在肾中不被破坏，可防止因IMP引起的肾小管坏死，减轻药物的肾毒性，增加疗效。两者合用后西司他丁减少IMP被肾小管上皮细胞的去氢肽酶水解，可使IMP的AUC增加20%，在尿中回收的原形药物多达70%，所以在制剂时IMP/CS以等量配制［1］。

IMP/CS适用于多种细菌的混合感染和需氧/厌氧菌的混合感染以及在尚未确定病原菌前的早期治疗，近年广泛用于抗感染治疗，取得满意结果，已成为治疗严重感染的一线药物。

对于原料CS的含量测定，国外药典采用电位滴定法［2］，国内未见报道。本研究建立HPLC法测定CS含量和有关物质，得到满意结果，现报道如下。

1仪器与试药

岛津LC2010A型高效液相色谱仪，Watersmillipore真空泵，SB5200型超声波仪，F13型酸度计，岛津MultiSpec1501紫外分光光度计。

CS原料3批(由某药厂提供；批号20044006、20044007和20044008)；CS对照品(纯度97.8%)由河北省药品检验所提供；乙腈为色谱纯，磷酸铵、磷酸二氢钾、盐酸、30%过氧化氢、氢氧化钠均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：DiamondC18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈∶0.1mol/L磷酸铵(精密称取磷酸铵20.31mg，加1000ml水使溶解并稀释至刻度，用磷酸调至pH6.8)(30∶70)；流速0.8ml/min；检测波长210nm；柱温50℃；进样量20μl，结果见图1。

1：西司他丁钠；2、3：未知杂质

图1西司他丁钠HPLC有关物质图谱

2.2系统适用性

(1)柱效与不对称度取CS对照品溶液进样，理论塔板数按CS峰计算为7070。

(2)进样精密度试验取CS对照品溶液连续进样5针，其峰面积的RSD为0.008%，表明系统精密度良好。

2.3专属性

对CS对照品进行高温、氧化、强酸、强碱的破坏性试验，以研究其降解产物与主峰的分离情况。

在选定的色谱条件下，取上述破坏后供试品溶液进样，结果主峰与各杂质峰获得有效分离，提示氧化和强酸破坏产生较大杂质，高温和强碱破坏总杂质量和杂质个数变化不大，表明CS在氧化、强酸条件下较不大稳定，强碱和高温对样品影响较小。

2.4

准确度

精密称取CS对照品及已知含量的样品各三份，分别置于100ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度，制成含量测定浓度的80%、100%和120%的溶液，摇匀，滤过，进样，结果低、中、高3个浓度的回收率(n=3)分别为100.1%(RSD=0.28%)、100.8%(RSD=1.24%)和99.8%(RSD=0.53%)；平均回收率为100.2%(n=9)(表1)，表明方法准确度良好。表1回收率测定结果

2.5线性和范围

精密称定CS对照品，置25ml容量瓶中，加水使溶解，加至刻度，分别制成0.0793、0.1586、0.3172、0.4758和0.6344mg/ml对照品溶液按“2.1”项色谱条件进行测定，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，结果在0.08～0.60mg/ml的浓度范围呈良好的线性，线性方程为：

y=5.178×107x-1.981×105r=0.9997

2.6方法精密度

同一批样品，分别进样6次，依法测定含量，结果含量的RSD为0.08%，表明方法精密度良好。

2.7检测限和定量限

以信噪比≈3时，注入仪器的量确定CS的检测限为1.8ng；以信噪比≈10时，确定CS的定量限为5.9ng。

2.8样品溶液的稳定性

在同一批样品的溶液，在0、1、2、3、4和5h分别进样进行考察溶液的稳定性，测得峰面积的积分值，结果RSD为0.78%，表明在室温(25℃)条件下，溶液放置6h，其主峰面积没有变化，保留时间也基本没有变化。因此，CS溶液稳定性好。

2.9重复性试验

分别平行制备6份CS供试品溶液。在上述色谱条件下，分别进样20μl，测得CS的含量。结果显示RSD为0.58%，说明本实验方法重复性好(表2)。

2.10有关物质的测定

原料测定溶液的制备精密称取CS15mg，置25ml容量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml容量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

测定方法量取对照品20μl注入液相色谱仪中，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%，再分别精密量取上述各溶液20μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图至20min(表3)。

表2重复性测定结果表3有关物质检测结果

2.11含量测定

对照品溶液的制备精密称定CS对照品适量，加水溶解并稀释成每1ml中约含CS0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含0.3mgCS的溶液，作为供试品溶液。

测定方法取CS原料3批，按上述方法制被测定溶液，各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算CS含量，结果见表4。

取CS原料3批(同上)，用电位滴定法进行试验，结果见表4。

3讨论

(1)流动相的选择CS的化学名为(Z)7［［(R)2氨基2羧乙基］硫］2［(S)2，2二甲基环丙烷甲酰氨基］2庚烯酸钠。由于分子结构中含叔胺结构，它易表4含量测定结果与固定相表面残余硅醇基形成氢键，发生次级保留效应，导致拖尾，故应在流动相中加入适当的添加剂，以限制硅醇基团对CS分子的作用。本文选用季胺类离子对试剂磷酸铵。磷酸铵与CS为同种电荷，在本色谱系统中，一方面与溶剂间存在静电排斥力，另一方面作用于固定相表面，抑制溶剂的亲硅醇基团效应，达到改善对称性，提高柱效，缩短溶质保留时间。在本试验中曾用0.1mol/L的磷酸溶液，但是同样浓度下改善峰形的效果远不如磷酸铵。在流动相中加入较低浓度的磷酸调节pH至6.8，有助于保持峰形的对称性。在流动相的pH选择上，曾用pH5.5、pH6.0，、H6.5以及pH6.8但都不及pH6.8，在此条件下，主峰保留时间缩短，柱效明显增加。有机相选用30%的乙腈与磷酸铵混合，是用来加快CS的出峰时间，降低柱压，提高柱效，改善主峰与杂质峰的分离度。

(2)检测波长的选择取CS对照品适量，用水溶解并稀释至15μg/ml的溶液。在200～700nm波长范围内扫描，结果CS在此范围内无最大吸收波长，但考虑其边缘效应，同时考虑到其基线噪音的稳定性，故选择CS和杂质均有较高检测灵敏度作为测定波长。

(3)柱温的选择分别将柱温设为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，结果显示柱温对分离影响不大，但升高柱温可使系统平衡时间缩短，基线稳定性明显改善，降低了流动相的粘度和柱压，缩短了保留时间，提高柱效，适当改善峰形，使试验结果重现性更好。

(4)与电位滴定方法的比较电位滴定法测定CS含量时，共有三个突跃点，计算采用第一和第三突跃之间的滴定数差值。但是它的第一个突跃很不显著，影响结果的判定，也影响测定准确度。采用高效液相色谱法，简单、快速且准确度高。

致谢：本文的实验得到长治医学院2002级学生张文波和宋鑫鑫两位同学的大力协助。

【参考文献】

［1

］张建民，冯玲玲，李勇，等.抗菌药物增效剂［J］.中国药师，2003，6(3)：172～173.

［2］TheUnitedStatesPharmacopoeialConventionInc.TheUnitedStatesPharmacopoeiaXXVIII［S］.TheBoardofTrustees,2005:471～472.新晨