去甲肾上腺素对心肌细胞CGRP表达变化的影响

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摘要:目的 观察去甲肾上腺素（NE）诱导培养心肌细胞cgrp表达的变化。方法 采用1 d～3 d龄的Sprague-Dawley（SD）大鼠建立体外培养新生大鼠心肌细胞模型，选用20孔培养第4天～第5天呈亚融合状态下细胞随机分为5组,每组4孔，即对照组（C组）和NE1 h、3 h、6 h、12 h组。细胞培养基内加入NE后，取样本进行测定。采用免疫细胞化学染色技术观察心肌细胞内CGRP表达的变化。结果 NE组CGRP免疫反应阳性物质在各时点均较对照组增多,并随缺血时间延长呈现不同的变化趋势：1 h、3 h、6 h和CGRP免疫反应阳性物质显著增多，6 h达最高，12 h稍有下降。结论 NE在细胞水平可上调心肌细胞CGRP表达。

关键词:心肌细胞培养；去甲肾上腺素；降钙素基因相关肽

中图分类号：R542.2 R256.2 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）06-0703-02心肌缺血是常见的内脏缺血缺氧性损害。急性心肌缺血时，机体交感-肾上腺素能活性增强，不仅血浆儿茶酚胺水平上升，心脏组织的去甲肾上腺素（NE）浓度也明显增高【sup】［1］【/sup】。心肌缺血可诱发心肌损伤反应，心肌细胞凋亡、坏死及心功能降低等。目前的研究表明，降钙素基因相关肽（CGRP）是感觉神经末梢的肽类递质，也是免疫调节肽【sup】［2］【/sup】和前炎症介质【sup】［3］【/sup】。组织炎症可刺激CGRP从局部感觉神经末梢分泌，引起组织的神经源性炎症，加重组织损伤。心肌缺血后，心肌组织中C-传入神经纤维不仅向中枢传递伤害性信息，而且在心肌局部释放CGRP等神经肽【sup】［4］【/sup】，参与心肌缺血损伤过程。NE对培养心肌细胞产生CGRP的影响如何？文献报道较少。本研究采用体外培养新生大鼠心肌细胞，模拟心肌缺血等应激状态，观察NE诱导下心肌细胞内CGRP表达的改变。探讨机体应激反应时神经源性反应介质NE对心肌细胞表达CGRP的影响。

1 材料与方法

1.1 心肌细胞培养及分组 采用1 d～3 d龄的SD大鼠（由山西医科大学实验动物中心提供）心肌细胞进行体外培养。参照Webster等【sup】［5］【/sup】的方法，无菌条件下取出生后1 d～3 d的SD新生大鼠心室剪碎成约1 mm【sup】3【/sup】大小的组织块，用0.08%胰酶溶液反复消化、分离、收集细胞悬液。应用差速贴壁分离法去除贴壁的非心肌细胞，采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基将心肌细胞稀释成适当浓度的细胞悬液，按一定密度（5.0×10【sup】5【/sup】/mL）接种于6孔培养板，在37 ℃ CO【sub】2【/sub】培养箱中培养4 d。24 h换培养基1次。在最初2 d，于培养液中加入0.1 mmol/L的5-溴脱氧嘧啶核苷抑制非心肌细胞生长。采用生长呈亚融合状态且同步搏动良好的原代培养心肌细胞用于实验。于心肌细胞培养第4天，换用无血清DMEM培养，1 d后加药。20孔细胞随机分为5组,每组4孔，即对照组（C组）和NE1 h、3 h、6 h、12 h组，取样本进行测定。行免疫组织化学染色方法检测CGRP表达。

1.2 免疫组织化学染色测定CGRP 采用山羊抗大鼠CGRP多克隆抗体（美国Sigma公司）检测心肌细胞CGRP表达（SP免疫细胞化学染色试剂盒和DAB染色试剂盒由武汉博士德生物公司提供）。采用显微镜（日本Olympus BX-51）及IDA-2000数码显微图像分析系统（中科院北京空海科技发展有限公司）进行图像分析。每张片子随机选择10个视野，分析其平均光度和阳性单位。

心肌细胞分泌CGRP的免疫细胞化学SP法鉴定：培养第5天，选取细胞密度均匀、搏动好的16个孔，进行SP法鉴定，具体如下：① 吸去上清液，取出盖玻片（有细胞面用朝上），应用PBS冲洗，5 min×3次。②细胞固定：4%多聚甲醛固定20 min,应用PBS冲洗，5 min×3次。③ 将盖玻片细胞面朝上放在载玻片上，标记笔画定反应的范围。④ 每张盖玻片滴加50 μL非免疫动物羊血清（BSA），封闭非特异背景，放湿盒中，常温30 min。⑤甩去多余的BSA，每张盖玻片滴加50 μL第一抗体（anti-α-sarcomeric-actin 抗体，小鼠抗大鼠IgGMc Ab），4 ℃过夜。⑥冰箱中取出湿盒，室温放置1 h，用PBS冲洗，3 min×3次。⑦加生物素化羊抗小鼠IgG，室温放置2 h,用PBS冲洗，3 min×3次。⑧ 加SP，室温放置20 min,用PBS冲洗，5 min×4次。⑨ 每张盖玻片滴加100 μL新鲜配制的DAB液，显微镜下观察5 min。⑩ 自来水冲洗，水溶性封片剂封片，光镜下观察并进行照相，采集图像。采用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 形态学观察 培养的细胞初为圆形或椭圆形，以后伸展成为长杆形、多角形、梭形等形态。24 h后可见心肌细胞贴壁，48 h～72 h形成细胞单层，细胞膜突起呈分枝相连成簇状、片状，以同心圆放射状排列，并可见心肌细胞特有的同步化搏动，频率12 /min～80 /min。

2.2 免疫细胞化学染色结果（见表1） 细胞核周围及核内可见CGRP免疫组织化学染色阳性棕黄色颗粒状物质（SP法）。NE组CGRP免疫反应阳性物质在各时点均较对照组增多,并随缺血时间延长呈现不同的变化趋势：1 h、3 h、6 h和CGRP免疫反应阳性物质显著增多，6 h达最高，12 h稍有下降。

表1 两组心肌细胞CGRP免疫细胞化学染色结果的比较（x±s）

3 讨 论

细胞是生物体结构和功能的基本单位，各种生命活动均以细胞为基础而完成。细胞培养作为基础研究技术之一，以其简单、经济、可靠和便于控制等优点，已被广泛用于医学和生物学的各个领域。

在心肌缺血时，交感-肾上腺能系统的活性明显增高，同时疼痛、焦虑等一系列伤害性神经精神活动也参与其中，导致心脏局部和全身儿茶酚胺（CAs）增高，从而加重心肌损伤。有资料已经证实，急性心肌梗死期间,患者交感-肾上腺素能活性增强,并且一系列证据都提示交感-肾上腺素能活性增强是急性心肌梗死期间发生致命性室性心律失常和加重缺血心肌损伤的重要原因之一。心肌缺血时,血浆CAs浓度增高是疼痛、焦虑和一系列其他反射活动的结果。心肌缺血15 min～20 min后，非胞裂外排释放的NE在局部心肌的浓度达正常血浆浓度100～1 000倍【sup】［1］【/sup】。NE是中枢和外周神经系统的经典神经递质，能够调节机体的多种生理功能。NE对心脏的不同作用主要是通过肾上腺素能受体的不同亚型介导，具有正性变时、正性变力、正性变传导作用以及松弛效应。另外，NE还可导致心律失常、心脏肥大等不良效应。大量NE合成、释放对心肌细胞具有直接和间接的细胞毒作用。心肌缺血可诱发心肌损伤反应、心肌细胞凋亡、坏死以及心功能降低等。

本实验室前期的在体研究表明，缺血心肌CGRP表达增强，吗啡预先给药在一定程度上抑制了CGRP的表达，对心肌具有一定的保护作用。本研究模拟心肌缺血状态下交感-肾上腺髓质系统兴奋时NE水平（10【sup】-8【/sup】 mol/L），采用体外培养细胞给予NE诱导，应用免疫细胞化学染色技术，从蛋白水平观察心肌细胞CGRP表达的变化，发现各时点NE均能促进CGRP表达的增加，其中6 h时点NE的作用最强， 这种随着NE作用时间延长，CGRP表达有所变化的现象提示：NE影响CGRP表达的机制比较复杂，可能高浓度的NE可以通过多种途径产生多种效应，包括直接诱发心肌细胞损伤、坏死【sup】［6］【/sup】，表现为心肌细胞的功能降低甚至缺失，综合效应表现为NE诱导CGRP表达作用减弱。

综上所述，一定浓度的去甲肾上腺素可诱导心肌细胞表达CGRP增加。这仅仅是神经源性机制在伤害性刺激引起的（多）器官损伤中作用系列研究的一部分内容，有关这种变化在急性心肌缺血损伤中的作用和意义，以及对心肌组织结构、功能有何影响？尚待进一步研究。

参考文献：

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［5］ Webster KA,Discher DJ,Bishopric NH.Induction and nuclear accumulation of fos and jun proto-oncogenes in hypoxic cardiacmyocytes［J］.J Biol Chem,1993,268：30-40.

［6］ Waldenstrm AP,Hjalmarson AC,Thornell L.Possible role of noradrenaline in the development of myocardial infarction［J］.Am Heart J,1978,95:43-51.

作者简介：李岩（1978―），女，医学硕士，助教，现工作于山西医科大学（邮编：030001）；吕志敢，工作于山西医科大学。

（收稿日期：2011-03-02）