北合欢质量控制探讨
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[摘要]目的提高北合欢中药材的质量控制标准。方法增加薄层色谱鉴别方法；槲皮素、山柰素的HPLC含量测定方法，色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus c18（5um，4.6mm×250mm），流动相甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50），流速1.0mL/min，检测波长360nm。结果薄层色谱图斑点显色清晰，色谱分离良好；槲皮素在进样量0.001-1ug、山柰素在进样量0.005-10ug范围内与峰面积有良好的线性关系，y=3847.7x+0.4811（r=1.0000）、y=4329.5x+84.852（r=0.9998）；平均回收率96.4%（RSD1.7%）。结论本研究为提高北合欢药材质量标准提供了参考。
[关键词]北合欢；薄层色谱法；高效液相色谱法
[中图分类号]R931
[文献标识码]A
[文章编号]2095-0616（2017）03-49-04
北合欢别名藤合欢、南蛇藤果，东北地方习用药材，常代替合欢花使用，为卫矛科植物南蛇藤Celastrus orbiculatus Thunb.的干燥果实。性味甘、平，具有舒郁、理气、安神、活络的作用，主治郁结胸闷，失眠，健忘，视物不清，咽痛，痈肿，跌打损伤疼痛等症。化学成分研究表明北合欢具有抑菌、镇静催眠、抑制肿瘤细胞增殖、抑制NF-kB活性的作用，具有潜在的药用开发价值。北合欢是中成药舒神灵胶囊、心舒胶囊、益心宁神片等处方中的组成药味，质量标准仅载于《吉林省中药材标准》1977年版Ⅲ、《辽宁省中药材标准》2009年版。检验项目为性状、显微鉴别、水分、灰分、浸出物，现有质量标准无法有效的控制北合欢的药材质量，本方法的建立，通过对照药材比对进行薄层色谱鉴别，HPLC法测定槲皮素、山柰素的含量控制药材质量。经过不同产地采集的10批样品实验结果分析制定各检验项目限值，为更好的控制北合欢药材的质量提供科学的依据。
1.仪器与材料
Agilent 1260高效液相色谱仪：四元梯度泵，真空脱气机，柱温箱，自动进样器，数据处理器；HH--4数显叵温水浴锅（中国甄城华鲁电热电器有限公司山东）；薄层加热板（瑞士卡玛）；XS105电子天平（梅特勒一托利多仪器上海有限公司）；GZX-DH-26×30-TBS台式电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；SX-G07103马弗炉（天津市中环实验电炉有限公司）。
甲醇（色谱纯，美国生物），重蒸水（自制）。分析纯甲醇、乙醚、乙醇、磷酸、盐酸、硫酸、甲苯、乙酸乙酯、氢氧化钾（北京化工厂）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂，20140418）。藤合欢（南蛇藤果）对照药材购于中国食品药品检定研究院（批号：121547-200501），槲皮素对照品购于中国食品药品检定研究院（批号：100081-200907），含量为96.2%；山柰素对照品购于中国食品药品检定研究院（批号：110861-201310），含量为93.2%。10批样品为产地收集，经长春中医药大学张景龙鉴定为卫矛科植物南蛇藤Celsius orbiculatus Thunb.的干燥果实。
2.方法与结果
2.1性状
本品呈圆球形，果皮常开裂成三瓣，偶有四瓣，基部相连，易脱落，各果瓣长约6～9mm，直径6～7mm，鲜黄色至橙黄色，卵圆形，顶部有尖突起，内面有一纵隔。每一果实有种子6粒，外被红色肉质假种皮，集成球形。剥去假种皮可见卵形种子，表面灰棕色，光滑。气清香，味苦、甘。
2.2鉴别
2.2.1显微鉴别草酸钙簇晶直径10～50um，棱角稍尖或较钝。草酸钙方晶散在或分布在薄壁组织中。石细胞单个散在或数个成群，类圆形、长方形或长条形，有的末端较尖，层纹及纹孔明显。螺纹、梯纹导管常见，细小。
2.2.2薄层色谱取本品粗粉1g，加氢氧化钾甲醇溶液（氢氧化钾10g，加甲醇20mL使溶解，加水定容至50mL）50mL，加热回流45min，滤过，滤液加乙醚50mL振摇提取，取乙醚液用水洗涤3次，每次20mL，乙醚液蒸干，残渣加乙醇lmL使溶解，作为供试品溶液。另取藤合欢（南蛇藤果）对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯一乙酸乙酯（9：4）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图1。
2.3检查
水分以烘干法测定，10批结果为5.8%～9.9%。总灰分、酸不溶性灰分10批结果分别为4.7%～6.6%；0.2%～1.7%。二氧化硫残留量10批结果为0～10mg/kg。铅、镉、砷、汞、铜10批结果分别为0.5～2.2mg/kg未检出0.6～1.6mg&g、0.001～0.01mg/kg2.7～4.0mg，kg。9种有机氯农药残留量10批样品均未检出六六六、滴滴涕、五氯硝基苯农药残留。
2.4浸出物
取本品，照四部通则2201项下醇溶性热浸法测定，用乙醇作溶剂，10批测定结果为27.5%～46.9%，平均33.6%。
2.5含量测定
2.5.1色谱条件与系统适用性试验色谱柱AgilentZORBAX Eclipse Plus C16 5um 4.6mm×250mm，流动相甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50），检测波长360nm，进样量10uL，理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。混合对照品溶液和供试品溶液的液相色谱图见图2、3。
2.5.2供试品溶液的制备取本品粉末（过三号筛）1g，精密Q定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%盐酸溶液一甲醇（1：6）的混合溶液100mL，称定重量，加热回流45min，冷却至室温，用上述溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
2.5.3对照品溶液的制备取槲皮素对照品、山柰素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL分别含12、25ug的混合溶液，作为对照品溶液。
2.5.4线性考察取槲皮素加甲醇制成每1mL含槲皮素0.I、0.5、1、5、10、50、100ug的溶液，以进样量（ug）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，槲皮素在进样量0.001～1ug范围内与峰面积有良好的线性关系，y=3847.7x+0.4811（r=1.0000）。
取山柰素对照品加甲醇制成每1mL含山柰素0.5、1、10、50、100、500、1000ug的溶液，以M样量（ug）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，山柰素在进样量0.005～10ug范围内与峰面积有良好的线性关系，y=4329.5x+84.852（r=0.9998）。
2.5.5精密度考察取本品粉末（过三号筛）1g，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，连续进样6针，槲皮素和山柰素含量RSD分别为0.4%，0.1%。表明该方法精密度良好。
2.5.6稳定性考察取本品粉末（过三号筛）1g，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0，4，6，8，12，24h测定槲皮素、山柰素含量，槲皮素和山柰素含量RSD分别为1.6%，1.3%。表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.5.7重复性考察取本品粉末（过三号筛）1g，共6份，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，计算槲皮素、山柰素含量，槲皮素和山柰素含量RSD分别为1.3%，0.7%。表明供试品溶液重复性符合分析方法的要求。
2.5.8回收率考察取已知含量的供试品（过三号筛）1g，共6份，精密加入槲皮素、山柰素总量共2.844mg，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，计算含量，回收率试验符合分析方法要求，结果见表1。
2.5.9样品测定取10批供试品，分别照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，计算含量，结果见表2。
3.讨论
因北合欢所含成分较复杂，种子内含油脂类成分可达到50%，直接提取不利于色谱斑点的分离，故选择以氢氧化钾甲醇溶液分解油脂类成分，达到提纯的效果，再以乙醚萃取，水洗乙醚液，乙醚液蒸干，得到易于观察的薄层色谱特征。考察了不同展开剂，甲苯一乙酸乙酯（9：4）、石油醚（60～90℃）一丙酮（3：1）、乙醚一氯仿（1：2），结果甲苯一乙酸乙酯（9：4）为展开剂时斑点显色清晰，薄层色谱斑点间分离效果较好。考察展开温度（5～30℃），相对湿度（18%～88%），不同厂家生产的薄层板，均能得到清晰的色谱斑点，分离度较好，说明本方法耐用性较好。
通过10批检验数据建议规定北合欢的水分检查结果不得过12.0%，总灰分不得过8.0%，酸不溶性灰分不得过3.0%。
试验考察了水溶性浸出物（冷、热）浸法、醇溶性浸出物（冷、热）浸法，结果以醇溶性浸出物热浸法所得含量较高。建议规定限值为按干燥品计，不得少于20.0%。
对铅、镉、砷、汞、铜、9种有机氯农药残留量进行测定，所得结果含量均较低或未检出，故考虑不列入质量标准中。
黄酮类为北合欢的主要成分，是一种很强的抗氧剂，可阻止细胞的退化、衰老。可以改善血液循环，降低胆固醇。黄酮的含量测定方法主要有分光光度法和高效液相色谱法，分光光度法操作简单，成本低，但误差大。目前测定黄酮的主要方法是Hasler创立的高效液相色谱法，其原理是在盐酸的作用下，将复杂的黄酮水解成槲皮素和山柰素，通过槲皮素和山柰素的含量得出总黄酮的含量。故选择槲皮素和山柰素为指标性成分进行含量测定。选择槲皮素、山柰素均有较大吸收的360nm作为检测波长，在酸性条件下将总黄酮水解为槲皮素和山柰素，考察振荡、超声和回流提取法确定回流提取所得含量最高，考察不同提取溶剂量、提取时间，最终确定了提取方法。以流动相甲醇0.4%磷酸（50：50）、甲醇一水一甲酸（44：55：1）、乙腈一水（40：60）进行试验，均能得到较好的分离效果，考虑乙腈毒性较强，故选择甲醇0.4%磷酸（50：50）为流动相。流动相酸性小范围变动时，对色谱峰的分离度和理论塔板数影响较小。流动相比例在（50：50）±5范围内变动时，含量结果无显著差异。流速在0.8～1.2mL/min范围内变动不影响检测结果。柱温在25―35℃范围内变动时对测定结果影响较小。考察三种不同厂家色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C10、岛津Wonda CractODS-2、Waters SunFire C10都能得到良好的分离度和理论塔板数，基线平稳，峰形对称性较好。通过10批样品测定结果，建议含量测定限值为按干燥品计算，含总黄酮以槲皮素（c15；H10O7）和山柰素（C15；H10O6）的总量计，不得少于0.20%。