香菇液体种生产工艺论文
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1实验方法
1.1菌株活化配制CPDA培养基，接种香菇南山1号菌株，28℃培养，待菌株满管后，4℃冰箱保藏备用。
1.2液体母种的制备配制母种培养基，取香菇南山1号0.5cm2菌块接种于母种培养基中，静置24h，28℃、170r/min振荡培养10d备用。
1.3生物转化量的测定将液体条件下培养好的香菇菌丝体抽滤至不滴水，电子分析天平称重。
1.4单因素试验碳源筛选试验：在碳源筛选培养基中，用10.0g玉米粉分别与麦芽糖、红糖、蔗糖和葡萄糖各20.0g组合作为碳源，配制培养基，将液体母种按照5%的接种量接种，静置24h，28℃、160r/min条件下培养10d，每种培养基3个重复，测定菌丝生物转化量，求平均值，观察不同碳源对香菇菌丝生长的影响，筛选出最佳碳源组合作为Plackett-Burman设计考虑因素。氮源筛选试验：在氮源筛选培养基中，用10.0g麦麸分别与酵母粉、蛋白胨、牛肉粉和NH4NO3各2.0g组合作为氮源，配制培养基，将液体母种按照5%的接种量接种，静置24h，28℃、160r/min条件下培养10d，每种培养基3个重复，测定菌丝生物转化量，求平均值，观察不同氮源对香菇菌丝生长的影响，筛选出最佳氮源组合作为Plackett-Burman设计考虑因素。
1.5Plackett-Burman设计试验根据单因素试验结果，选取11个因素(红糖、玉米粉、麦麸、牛肉粉、KH2PO4、MgSO4•7H2O、VB1、初始pH、接种量、温度、振荡速度)作为研究对象，进行Plackett-Burman设计试验，按照表4和表5配制培养基，接液体母种，静置24h，振荡培养10d，每组试验设3个重复，将菌丝球抽滤，测定菌丝生物转化量，求平均值，借助Minitab15软件对数据进行统计分析。
1.6最陡爬坡试验根据Plackett-Burman试验结果，以及各个显著影响因素效应的大小设定步长及变化方向进行试验。针对影响显著因素进行最陡爬坡试验，将正效应的值逐步增加，负效应的值逐步减小，设计试验找出峰值，以寻找快速最佳的响应区域。每种培养基设3个重复，接种后静置24h，振荡培养10d，将菌丝球抽滤，测定菌丝生物转化量。
1.7Box-Behnken试验设计与分析根据上述试验，以菌丝生物转化量为响应值，采用玉米粉（X2）、麦麸（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接种量（X11）进行4因素3水平的Box-Behnken试验设计，因素与水平编码见表1。
1.8数据处理与分析采用Minitab15软件和Excel数据分析工具中的t−检验(双样本异方差假设)对Plackett-Burman试验结果进行分析，并采用Design-Expert8.0.6软件对Box-Behnken试验结果进行分析。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1不同碳源对香菇菌丝体生长的影响按照1.2.4方法进行试验，观察不同碳源对香菇菌丝生长的影响，结果见表2。表2结果表明，不同碳源对香菇菌丝体生长的生物转化量不同，其中以红糖和玉米粉组合最好，菌丝生物转化量最高。以麦芽糖和玉米粉组合也显现出较高的生物转化量，葡萄糖和玉米粉组合的菌丝生物转化量最低。根据不同碳源组合培养基中香菇菌丝的生长状况和生物转化量,可确定红糖与玉米粉组合为最佳碳源，菌丝生物转化量为27.322g/L。
2.1.2不同氮源对香菇菌丝体生长的影响按照1.2.4方法进行试验，观察不同氮源对香菇菌丝生长的影响，结果见表3。表3结果表明，不同氮源对香菇菌丝体生长的生物转化量不同，其中以牛肉粉和麦麸组合最好，菌丝生物转化量高。以酵母粉和麦麸组合作为氮源也显现出较高的生物转化量，NH4NO3和麦麸组合的菌丝生物转化量最低。根据不同氮源组合培养基中香菇菌丝的生长状况和生物转化量,可确定牛肉粉与麦麸组合为最佳氮源，菌丝生物转化量为30.343g/L。
2.2Plackett-Burman设计试验选用试验次数n=12的Plackett-Burman试验设计，考察X1(红糖)、X2(玉米粉)等11个因素，根据前期试验结果，每个因素取两水平，以菌丝生物转化量Y为响应值。同时借助Minitab15软件对实验结果进行统计分析，并通过t−检验从11个因素中选出了4个最显著影响因素，结果见表4和表5。表4和表5结果表明，对香菇菌丝生物转化量影响的显著因素：玉米粉（X2）、麦麸（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接种量（X11）。其中，X2、X3和X11在增加的时候，菌丝生物转化量的值明显增加，为正效应因素。而X6在量增多的时候，菌丝生物转化量反而降低，因此X6为负效应因素。
2.3最陡爬坡试验响应面拟合只有在邻近最大响应区域后才能最好地反映出真实情况，故要先逼近最佳响应区域。根据Plackett-Burman试验结果，将玉米粉（X2）、麦麸（X3）和接种量（X11）的值逐步增加，MgSO4•7H2O（X6）的值逐步减小。根据Minitab15软件试验分析，其他因素取高水平，结果见表6。表6结果表明，在玉米粉24.0g/L，麦麸14.0g/L，MgSO4•7H2O1.1g/L，接种量14.0%时，测得香菇菌丝生物转化量最大为29.214g/L，所以此为最佳响应区域。
2.4Box-Behnken试验设计与分析按照表1中因素水平，借助Design-Expert8.0.6软件进行4因素3水平Box-Behnken试验设计，结果见表7。
2.5回归模型方差分析结果经Design-Expert8.0.6软件，以玉米粉（X2）、麦麸（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接种量（X11）为响应变量，以菌丝生物转化量（Y）为响应值对表7结果进行处理，得到表8回归方程方差分析表，利用软件进行非线性的二次多项式拟合。
2.6响应面及等高值分析结果根据回归方程绘制菌丝生物转化量随各因素变化的响应曲面图，由响应曲面图可知玉米粉、麦麸、MgSO4•7H2O、接种量4个因素对香菇菌丝生物转化量的影响(图1、图2)。每个响应曲面分别代表着两个独立因素间的相互作用，其余两个因素保持在编码水平的0水平。图1结果显示，在一定接种量条件下，随着玉米粉含量增加，香菇菌丝生物转化量呈上升趋势；在玉米粉含量较低条件下，随着接种量的增加，香菇菌丝生物转化量呈上升趋势；在玉米粉含量较高条件下，接种量对香菇菌丝生物转化量影响不明显。图2结果显示，在低硫酸镁含量条件下，随着麦麸含量增加，香菇菌丝生物转化量呈上升趋势；在高硫酸镁含量条件下，随着麦麸含量增加，香菇菌丝生物转化量呈下降趋势；在低麦麸含量条件下，随着硫酸镁含量增加，香菇菌丝生物转化量呈上升趋势；在高麦麸含量条件下，随着硫酸镁含量增加，香菇菌丝生物转化量呈下降趋势。在实际生产过程中，为了降低成本，尽可能使用有机廉价的原料，所以在“criteria”选项中选择MgSO4•7H2O为最小值，玉米粉、接种量、麦麸为平均值，香菇菌丝生物转化量为最大值，利用Design-Expert8.0.6得到香菇南山1号菌株液体种的最优生产工艺条件：玉米粉36.0g、麦麸21.0g、红糖20.0g、牛肉粉4.0g、KH2PO43.0g、MgSO4•7H2O0.6g、VB110.0mg、H2O1.0L，初始pH6.2、接种量7.0%、温度29℃、180r/min振荡发酵10d，菌丝生物转化量拟合值为49.956g/L。
2.7验证试验根据最优生产工艺条件参数对模型进行验证，继续发酵培养，最终得到香菇菌丝生物转化量为51.004g/L，在初始培养条件下菌丝生物转化量为29.214g/L，优化后提高了1.75倍。实测值与拟合值相比，相对误差约为2.098%。该结果表明，响应面法优化香菇液体种最佳生产工艺条件是可行有效的。
3结论
本试验在单因素试验的基础上，通过响应面分析法对香菇南山1号菌株液体种生产工艺条件进行了优化，并得到回归方程，表明玉米粉（X2）、麦麸（X3）、MgSO4•7H2O（X6）、接种量（X11）对响应值均有显著影响，接种量和玉米粉、麦麸和MgSO4•7H2O交互作用显著。经回归分析并结合生产实际，确定香菇南山1号菌株的液体种生产工艺条件为玉米粉36.0g、麦麸21.0g、红糖20.0g、牛肉粉4.0g、KH2PO43.0g、MgSO4•7H2O0.6g、VB110.0mg、H2O1.0L、初始pH6.2、接种量7.0%、温度29℃、180r/min摇床发酵10d，此条件下菌丝生物转化量为51.004g/L，比之前得到大幅度提高。实测值与拟合值相比，相对误差约为2.098%。说明该模型可靠性较高，能很好地预测试验结果。相比现有报道，本研究所得香菇菌丝生物转化量较高，菌丝球小、密度大且大小均匀，同时生产工艺简单且成本低，可为香菇南山1号菌株的液体种生产和栽培提供理论参考。
作者：陈文强乔艳明单位：陕西理工学院生物科学与工程学院陕西省食药用菌工程技术研究中心