不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌中的表达
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作者：沈才飞，白雪帆，牟丹蕾，黄长形
【关键词】 丙型肝炎病毒；核心蛋白；突变；原核表达
Expressions of different deletion mutated HCV core protein genes in E.coli
【Abstract】 AIM: To construct the recombinant plasmids expressing fulllength HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes and to express them in E.coli. METHODS: Entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated gene fragments from HCV core protein which respectively coded 1-191aa, 1-59aa plus 81-191aa, 1-169aa, 1-59aa plus 81-169aa were amplified by PCR and cloned into expression vector pRSETA, thus forming different recombinant plasmids （pRSETAC573, pRSETAC510, pRSETAC507, pRSETAC444）, which were transformed into E.coli BL21 （DE3） pLysS and induced by IPTG. SDSPAGE and Western blot were used to test and identify expressed 6×Hisfusion proteins. RESULTS: Restriction analysis and sequencing confirmed that the 4 recombinant plasmids expressing entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes were successfully constructed. Both SDSPAGE and Western blot analysis showed entire HCV core protein gene and 3 different deletion mutated hepatitis core protein genes were expressed, and the respective molecular weights of the products were about 21×103, 19×103, 19×103 and 16.5×103. The fusion protein production accounted approximately for 20% of total bacterial protein. CONCLUSION: Different deletion mutated HCV core protein genes were expressed efficiently in E.coli.
【Keywords】 hepatitis C virus; core proteins; mutation; prokaryotic expression
【摘要】 目的： 构建丙型肝炎病毒（HCV）全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中表达. 方法：用PCR方法扩增基因型为1b型的HCV核心蛋白的全长及3种不同缺失突变的基因片段，对应氨基酸分别为C573：1-191aa，C510:1-59aa+81-191aa，C507:1-169aa，C444:1-59aa+81-169aa. 将其克隆到高效表达载体pRSETA中构成重组质粒（pRSETAC573，pRSETAC510，pRSETAC507，pRSETAC444），转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS. IPTG诱导表达6×His融合蛋白，表达产物经SDSPAGE及Western blot检测和鉴定. 结果： 经酶切鉴定及测序证实全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因的原核表达载体构建正确. 经SDSPAGE及Western blot显示在Mr约为21×103, 19×103, 19×103, 16.5×103处出现融合表达条带. 融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的20％. 结论：全长及3种不同缺失突变的丙型肝炎病毒核心蛋白基因均在大肠杆菌中得到有效表达.
【关键词】 丙型肝炎病毒；核心蛋白；突变；原核表达
【中图号】 R512.630.27
0引言
丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）感染已成为全球性的社会公共卫生问题，迄今尚无有效的预防性疫苗. HCV白基因相对保守［1］并且能诱导CTL反应及ADCC，有可能用于开发HCV预防及治疗性疫苗. 我室曾扩增羧基末端的20个氨基酸和（或）第60~80位氨基酸多肽基因缺失的白基因，并在真核细胞中表达成功，初步证实突变掉上诉两个肽断能提高机体免疫反应［2-3］. 为进一步探讨不同缺失突变核心蛋白对免疫反应的影响，我们构建了HCV核心基因不同缺失突变基因片段的原核表达载体并在大肠杆菌中进行了表达.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1质粒与菌株源质粒pCI573, pCI510, pCI507, pCI444系本室将不同缺失突变的核心蛋白基因克隆入真核表达载体pCIneo中构建而成，其中分别插入了自西安地区患者血清中克隆的1b型HCV完整的核心蛋白基因（573 bp）, 60～80位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（510 bp）, 羧基末端20位氨基酸缺失的核心蛋白基因片段（507 bp）, 同时突变掉60～80位氨基酸和羧基末端20位氨基酸的核心蛋白基因片段（444 bp）. 原核表达载体pRSETA为Invitrogin公司产品，中间克隆载体pGEMT easy为Promega公司产品. E. coli JM109由本室保存,BL21为Invitrogin公司产品.
1.1.2工具酶及主要试剂DNA快速提取试剂盒购自上海华瞬生物工程公司、高保真PCR 试剂盒、DNA分子量标准、蛋白分子量标准均为大连宝生物工程公司产品，HindⅢ, BamHⅠ, T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒购自Promega公司. 抗His抗体购自Invitrogin公司，二抗及显色试剂购自Sigma公司.
1.2方法
1.2.1PCR引物设计根据源质粒pCI573, pCI510, pCI507, pCI444中HCV核心蛋白基因起始密码子下游及终止密码子上游核苷酸序列设计了3条引物（上海鼎安生物技术有限公司合成）: 上游引物P1: 5′ GTGCGGATCCATGAGCACGAATCCTAAAC 3′, 下游引物： P2: 5′ TCGCAAGCTTTCACAAATTTCCCTGTTGTTGCATA 3′, P3: 5′ TCGCAAGCTTTCAAGCGGAAGCTGGGGTGGTCAG 3′. 在其上游引物引入BamHⅠ酶切位点、下游引物引入HindⅢ酶切位点.
1.2.2目的片段的扩增分别以质粒pCI573, pCI510, pCI507, pCI444为模板进行PCR扩增，扩增过程中模板与引物对应如下：pCI573, pCI510为P1, P2； pCI507, pCI444为P1, P3. 循环参数为94℃ 5 min, 94℃ 1 min, 55℃ 50 s, 72℃ 1 min共进行30个循环，最后于72℃延伸10 min. 取5 μL PCR反应液在10 g/L的琼脂糖凝胶电泳上进行扩增产物检测分析.
1.2.3重组质粒的构建及鉴定将4种PCR产物按1：3与中间载体pGEMT easy连接，转化感受态细胞JM109，挑阳性克隆接种扩增，小量提取质粒DNA，并以HindⅢ, BamHⅠ双酶切进行鉴定后交上海鼎安生物技术有限公司测序. 测序正确后将中间连接产物pGEMT easy573, pGEMT easy510, pGEMT easy507, pGEMT easy444用HindⅢ, BamHⅠ双酶切，胶回收酶切产物与经相应双酶切的pRESETA质粒连接. 转化感受态细菌JM109，挑阳性克隆接种扩增，小量提取质粒DNA，并以HindⅢ, BamHⅠ双酶切进行鉴定后交上海鼎安生物技术有限公司做序列测定.
1.2.4融合蛋白的诱导表达将重组质粒pRSETAC573, pRSETAC510, pRSETAC507, pRSETAC444转化BL21感受态细菌. 30℃振摇扩增转化细菌，3 h后（A600 nm约为0.6）加IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导表达,分别于1, 3, 5和7 h后收菌. 12 000 g离心5 min,菌体沉淀重悬于100 μL 20 mmol/L磷酸盐缓冲液中,于液氮中和42℃反复冻融4次,以最大速度4℃离心10 min,然后分别在上清和沉淀中加入100 μL及200 μL 1×SDSPAGE上样缓冲液，置于-20℃备用.
1.2.5SDSPAGE融合蛋白定量及Western blot检测融合蛋白用18％的分离胶SDSPAGE电泳后将蛋白转移到NC膜上，以50 g/L脱脂奶TBST封闭，以小鼠抗His抗体（1∶100）为一抗，生物素标记的抗鼠抗体（1∶500）为二抗进行抗原抗体反应.然后将NC膜浸入含链酶亲和素过氧化物酶（1∶500）的TBST中室温振摇1 h，最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍氨法显色.
2结果
2.1表达载体的构建及鉴定亚克隆重组质粒pGEMT easy573, pGEMT easy510, pGEMT easy507, pGEMT easy444以及终载体pRSETAC573, pRSETAC510, pRSETAC507, pRSETAC444用HindⅢ, BamHⅠ双酶切后，用琼脂糖凝胶进行电泳分别在约573, 510, 507和444 bp处出现条带，与预期分子量相符（图1）. DNA双向测序证实插入片段序列及读码框均正确，表明质粒构建成功.
图1重组质粒的限制性酶切分析（略）
2.2融合蛋白的表达与分析经SDSPAGE电泳检测，在Mr约21×103, 19×103, 19×103, 16.5×103处出现条带，均与预期的目的条带分子量一致. 条带随诱导时间延长颜色加深，经IPTG诱导5 h时目的蛋白量最多. 经薄层扫描测定，融合蛋白的表达量约占菌体总蛋白的20%. 表达蛋白大部分以包涵体形式存在于菌体沉淀中，上清中也可见明显蛋白条带（图2）.
2.3融合蛋白的Western blot结果显色后Mr约21×103, 19×103, 19×103, 16.5×103处出现蓝色条带，与预期的所要表达的6×His融合不同缺失突变白分子量大小相符，表明目的蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达(图3）.
图2融合蛋白表达的SDSPAGE分析（略）
图3融合蛋白的Western blot分析（略）
3讨论
近年来，核心蛋白的抗病毒免疫成为丙型肝炎的一个研究热点，但研究发现全长的核心蛋白不能诱导有效的CTL效应. 有学者推测核心蛋白的某些区段对机体免疫反应有抑制作用，为证实这一推断，国内外学者［4-7］对HCV核心蛋白各个区段的功能作了大量研究. 有研究［8］用截去HCV基因羧基末端的核心蛋白（1~176位氨基酸）的表达产物免疫小鼠，发现白特异性抗体滴度在初次免疫第16周时急剧升高到1∶8000并至少持续到27 wk，同时诱导出特异性T细胞增殖反应. 另一研究小组［9］研究证明：截去羧基末端的白基因的质粒免疫小鼠能够刺激IFNγ的产生，并诱导出强烈的白特异性迟发性超敏反应. Langhans等［10］报告来源于HCV核心蛋白第59~83氨基酸合成肽具有抑制HCV感染者外周血T细胞针对核心蛋白的增殖反应. 作者认为该多肽片段干扰了对白的抗原提纯. 为进一步探讨不同缺失突变核心蛋白对免疫反应的影响，我们将全长及3种不同缺失突变的核心蛋白基因在大肠杆菌中进行大量表达.
我们采用了原核表达载体pRSETA,该载体有两个特点：一是含有T7启动子，可被T7 RNA聚合酶识别，T7 RNA聚合酶的转录效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍，能够高效转录mRNA，大量表达目的蛋白. 二是载体上携带有6个His残基，分子量仅为840，对目的蛋白的结构和生物学活性影响很小，而且便于纯化. 本研究用该载体获得了目的蛋白的高效表达，同时我们还观察到IPTG最佳诱导时间为5 h. 为减少核心蛋白本身的细胞毒性作用，采取了30℃诱导. 总之，本研究成功构建了不同截短核心蛋白基因的原核表达载体，获得了正确的表达蛋白，为进一步研究HCV核心蛋白各区域的免疫学功能打下了基础.
【参考文献】
［1］ Hijikata M, Kato N, Ootsuyama Y, et al. Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis C virus genome by in vitro processing analysis［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 88 (1991):5547-5551.
［2］ 洪沙，黄长形，杨为松，等. 第60~80位氨基酸多肽片断缺失的HCV白在真核细胞中的表达［J］. 第四军医大学学报，2005，26（12）：1101-1104.
［3］ 洪沙. 缺失突变对丙型肝炎核心蛋白免疫的影响［D］. 西安：第四军医大学博士论文集, 2005.
［4］Klein KC, Dellos SR, Lingappa JR. Identification of residues in the hepatitis C virus core protein that are critical for capsid assembly in a cellfree system［J］. J Virol， 2005, 79(11): 6814-6826.
［5］ Kim HS, Lee JK, Yang IH, et al. Identification of hepatitis C virus core domain inducing suppression of allostimulatory capacity of dendritic cells［J］. Arch Pharm Res， 2002, 25(3): 364-369.
［6］ Yang XB, Chen Z, Luo DH, et al. Proapoptotic and pronecrosis effect of different truncated hepatitis C virus core proteins［J］. J Zhejiang Univ Sci, 2005,6B(4):295-300.
［7］ Suzuki R, Sakamoto S, Tsutsumi T, et al. Molecular determinants for subcellular localization of hepatitis C virus core protein ［J］. J Virol， 2005, 79(2): 1271-1281.
［8］ DuenasCarrera S, AlvarezLajonchere L, AlvarezObregon JC, et al. A truncated variant of the hepatitis C virus core induces a slow but potent immune response in mice following DNA immunization［J］. Vaccine， 2000, 19(78): 992-997.
［9］ AcostaRivero N, DuenasCarrera S, AlvarezLajonchere L, et al. HCV core proteinexpressing DNA vaccine induces a strong class Ibinding peptide DTH response in mice ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2004, 314(3): 781-786.
［10］ Langhans B, Lechmann M, Ihlenfeldt H, et al. A hepatitis C virus (HCV) core protein derived peptide inhibits HCV specific lymphocyte proliferation［J］. Eur J Med Res, 2000, 5(3): 115-120.