超声波―微波协同提取何首乌多糖的工艺研究

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摘要：研究了超声波-微波协同提取何首乌[Fallopia multiflora（Thunb.） Harald.]多糖的最佳工艺条件，以何首乌多糖提取率为综合指标，考察料液比、提取次数、超声时间、微波时间4个因素对提取效果的影响，在此基础上，利用中心组合试验设计对提取工艺进行优化，最佳工艺条件为料液比1∶21（g∶mL），超声时间15 min，微波时间3 min，提取1次，在此条件下多糖实际提取率可达19.74%。

关键词：何首乌[Fallopia multiflora（Thunb.） Harald.]；多糖；微波；超声波；提取

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2867-05

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.11.039

何首乌[Fallopia multiflora （Thunb.） Harald.]既是中国名贵中药材，又是食疗保健佳品[1]。按其炮制方法不同分为生首乌和制首乌。生首乌味苦、涩，性平，具有解毒、消痈、润肠通便的功效；制首乌苦、甘、涩，性温，具有补肝肾、益精血、乌须发等功效[2]。多糖广泛存在于植物、微生物和海藻中。近年来，对制何首乌多糖的生物活性的评价研究表明，制何首乌多糖具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、降血脂及抗老年痴呆症等功效[3-5]，开展对何首乌多糖提取工艺的研究对中国何首乌资源的综合利用、产品的商业化生产等具有重要意义。

超声波-微波协同提取法充分利用超声波振动的空化作用以及微波的高能作用，使何首乌样品各点受到的作用一致，降低目标物多糖与样品基体的结合力，加速多糖从固相进入溶剂的过程[6-8]。本试验根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，采用响应面分析法对制何首乌多糖的超声波-微波协同提取工艺进行优化，为制何首乌资源的深度开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

何首乌，购于聊城市药店；葡萄糖（AR），浓硫酸（AR），苯酚（AR），无水乙醇（AR）。

QE-200型高速中药粉碎机，武义县屹立工具有限公司；赛多利斯万分之一电子天平，北京联合科仪科技有限公司；KQ3200型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；常压微波合成/萃取仪，新仪微波化学科技有限公司；SB-2000型水浴锅，上海爱朗仪器有限公司；UV-1800型紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 何首乌多糖提取工艺流程 何首乌粉碎过筛（20目）80%乙醇溶液预处理（料液比1∶6，g∶mL，70 ℃恒温水浴，搅拌1 h）抽滤通风干燥何首乌粉末加入一定量的去离子水超声波处理微波处理抽滤滤液定容测定吸光度。

1.2.2 标准曲线的绘制 精密称取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖25.1 mg，置于250 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得到质量浓度为0.100 4 mg/mL的葡萄糖标准溶液。准确吸取上述葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL分别置于10 mL容量瓶中，加入去离子水补至1.0 mL，各加5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，然后迅速加入浓硫酸5.0 mL，充分摇匀后，室温下放置20 min。以去离子水为空白，在490 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到葡萄糖浓度（C，mg/mL）与吸光度（A）的线性回归方程C=0.098 5A-0.012 7（R2=0.999 1），其中A与浓度C之间在0～0.08 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

1.2.3 何首乌多糖提取率的测定 何首乌多糖提取率采用以下公式计算：

何首乌多糖提取率=CV/M×100%

式中，C为提取液中多糖浓度；V为提取液的最终体积；M为何首乌样品的质量。

1.2.4 单因素试验 分别考察料液比、提取次数、超声时间和微波时间对何首乌多糖提取率的影响。①称取3.0 g何首乌粉末，固定超声时间15 min，微波时间3 min，按不同料液比1∶10、1∶15、1∶18、1∶20、1∶25（g∶mL，下同）加入去离子水，提取1次，测定提取液中多糖含量；②称取3.0 g何首乌粉末，固定料液比1∶10，微波时间3 min，超声时间分别为5、10、15、20、25 min，提取1次，测定提取液中多糖含量；③称取3.0 g何首乌粉末，固定料液比1∶10，超声时间15 min，微波时间分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 min，提取1次，测定提取液中多糖含量；④称取3.0 g何首乌粉末，固定料液比1∶10，超声时间15 min，微波时间3 min，分别重复提取1、2、3、4、5次，测定提取液中多糖含量。

1.2.5 响应面优化试验设计 在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，选择料液比、超声时间、微波时间、提取次数4个因素，采用四因素三水平响应面分析法优化提取工艺[9-11]，试验因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对何首乌多糖提取率的影响 由图2可知，随着料液比的增大，何首乌多糖提取率也逐渐升高，在料液比达到1∶20时，多糖提取率最高。一般来说，增大溶剂的量有助于目标成分的提取，固液接触面积增加，提取率提高；但是料液比过大会造成溶剂和能源的浪费，且后续浓缩和纯化压力增大。从节能和提高工作效率的角度考虑，溶剂用量不宜过大。因此，料液比取1∶20为宜。

2.1.2 超声时间对何首乌多糖提取率的影响 由图3可知，超声时间对何首乌多糖提取率的影响较为明显，在5～15 min范围内，随着时间的延长提取率明显升高，当超声时间达到15 min时，提取率最大，超过15 min后提取率开始急剧下降。这是因为超声波产生的强烈空化效应以及高速搅拌作用可以加快植物的溶胀和破碎，使得有效成分溶解率增加，提取率也相应增大。但超声时间过长，会使体系温度增加，一部分多糖被破坏。因此，选择超声时间15 min为宜。

2.1.3 微波时间对何首乌多糖提取率的影响 由图4可知，随着微波时间的增加，何首乌多糖提取率不断升高，当微波时间为3.0 min时，多糖提取率最高；而微波时间达到3.0 min后，提取率随微波时间的增加而降低，这可能是由于长时间高温破坏了多糖的结构，使得提取率降低。在实际提取过程中要考虑时间效率和成本因素，所以微波时间取3.0 min为宜。

2.1.4 提取次数对何首乌多糖提取率的影响 由图5可知，随着提取次数的增加，何首乌多糖提取率也随之增加。提取2次的多糖提取率明显增大，何首乌多糖已基本提取完全；当提取次数达到3次以后，提取率变化不明显，因此，选择提取2次为宜。

2.2 何首乌多糖提取工艺优化

2.2.1 响应面试验结果 为进一步优化何首乌多糖的提取条件，根据响应面分析因子和水平，以料液比（A）、超声时间（B）、微波时间（C）、提取次数（D）为自变量，以制何首乌多糖提取率为响应值，采用Design Expert 8.0.6软件进行响应面分析试验，试验方案与结果见表2。

2.2.2 数学模型的建立及显著性检验 采用Design Expert 8.0.6统计分析软件进行多元回归分析，得到何首乌多糖提取率与提取工艺各因素变量的二次回归方程：Y=-106.237 00+2.532 73A+3.172 80B+47.482 67C+0.804 00D-0.015 200AB+0.014 000AC-0.020 500AD-0.046 000BC+0.041 500BD+1.405 00CD-0.053 327A2-0.092 127B2-8.432 67C2-0.765 67D2。

回归方程中各变量对响应值影响的显著性由P值来判断，P值越小，则相应变量的显著程度越高，回归分析结果见表3，回归模型可信度分析结果见表4。

由表3可知，模型中的一次项B、二次项CD的影响达到显著水平（P

由表4可知，该回归模型相关系数R2=0.929 1，说明响应值何首乌多糖提取率有92.91%来源于所选变量，即料液比、超声时间、微波时间、提取次数。由方程显著性检验可知，该方程的模型拟合程度良好；失拟性分析表明，该回归方程无失拟性因素存在，且校正拟合度与预测拟合度在合理的水平内具有一致性，因此回归模型与实测值能较好地拟合；该试验的变异系数为3.79%，说明该模型的可靠性良好；信噪比为11.621，远大于4，说明该模型的精密度良好。综上所述，该回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。

结合回归数学模型分析，对上述二次回归方程求解，得到最佳提取条件为料液比1∶21.27，超声时间15.48 min，微波时间3.08 min，提取次数1.45次，在此条件下何首乌多糖提取率为19.82%。考虑到实际工艺条件的可操作性，将参数调整为料液比1∶21，超声时间15 min，微波时间3 min，提取次数1次。

2.2.3 响应面交互作用分析 采用Design-Expert 8.0.6软件处理数据，所得等高线与三维响应曲面见图6～图11。由等高线图的形状和疏密可以直观地看到各因素交互作用对响应值的影响。

2.3 最佳工艺条件下的验证试验

为了验证模型的有效性，进行重复验证试验，所得何首乌多糖平均提取率为19.74%，与理论预测值19.82%相差不大，表明预测值与实际值之间具有较好的拟合性，回归数学模型可以很好地预测不同条件下的提取率，具有一定的实用价值。

3 小结

本试验以何首乌为原料，采用超声波-微波协同提取技术对多糖提取工艺进行分析，采用中心组合试验和响应面分析法进行工艺优化，并建立了超声波-微波协同提取何首乌多糖提取率与料液比、超声时间、微波时间和提取次数关系的数学模型，由此模型获得了适宜的工艺参数：料液比1∶21，超声时间为15 min，微波时间为3 min，提取次数1次。在此条件下多糖提取率可达19.74%，与理论值19.82%相差不大，说明该回归方程模型具有较好的实际应用价值。

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