脑内乙酰胆碱与认知活动的关系
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摘要 脑内细胞外乙酰胆碱(ACh)的变化主要反映胆碱能神经元的活动，皮层和海马等脑区的ACh主要来源于基底前脑胆碱能神经元的纤维投射。应用微透析等技术在体检测清醒、自由活动动物认知过程中脑内乙酰胆碱的含量，可以研究ACh与特定行为反应和认知活动之间的关系。研究发现当机体需要对新刺激进行分析时，在学习与记忆、空间工作记忆、注意、自发运动和探究行为等认知活动中，基底前脑胆碱能神经元被激活，脑内ACh的释放也随之改变。结果提示脑内胆碱能递质系统活动与认知过程密切相关。
关键词 乙酰胆碱，学习与记忆，注意，自发活动量，探究行为。
分类号 B845
1 前言
乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)是中枢神经系统中第一个被测定其脑内含量的神经递质，脑内细胞外液中ACh的变化与中枢神经系统功能的改变有着密切的关系。Bulbring等(1941)首先检测了刺激外周神经引起的脊髓内ACh含量的变化，随后又有研究者陆续测定认知活动过程中皮层内ACh的改变，尤其是随着微透析等检测技术的发展，研究清醒、自由活动动物认知过程中的脑内ACh动态变化已经成为可能。结果发现当机体需要对新刺激(奖赏或惩罚)进行分析时，基底前脑胆碱能神经元被激活，皮层、海马等脑区内ACh的释放随着学习与记忆、注意、自发活动、探究行为等认知活动而发生改变。
脑内细胞外的ACh是由胆碱能神经末梢所释放，所以细胞外ACh的水平与胆碱能神经元的活动相一致。脑内主要的胆碱能系统是基底前脑至皮层和海马的胆碱能纤维投射。早期研究指出：刺激动物前爪、中脑网状结构和基底核以兴奋它们向皮层的投射，可同时引起感觉、运动皮层和顶叶皮层ACh释放；随后的一系列研究也证实大脑皮层处于激活状态时ACh的释放量大大高于基础状态。另一方面，应用电生理方法记录神经元的活动，发现ACh的释放量决定于神经轴突末梢内Ca2+浓度以及神经动作电位的频率；反之，利用微透析技术在灌流液中给予河豚毒阻断神经末梢的兴奋后，ACh的释放减少。以上实验均提示细胞外ACh的变化代表了胆碱能神经元的活动状态，而胆碱能系统向大脑皮层的兴奋投射是引起皮层兴奋的主要原因。
2 认知过程中脑内ACh的检测
静息状态下ACh储存在神经末梢的突触小泡内，当动作电位传导至神经末梢时释放到突触间隙，经扩散与突触前和突触后的M和N胆碱能受体结合，最后被胆碱酯酶水解。多数研究者采用生化、生物学和免疫组织化学方法测定脑组织匀浆中ACh的含量，但脑组织被匀浆后ACh损失很多，造成检测的灵敏度较低：而且为了阻止ACh的分解，需用微波辐射法处死动物以迅速灭活代谢酶。为了研究认知活动过程中脑内ACh含量的动态变化，杯形技术(Cup Technique)和微透析技术(MierodialysisTechnique)先后得到广泛应用，尤其是针对清醒、自由活动动物认知活动的研究。
杯形技术：通过在脑膜上轻微施压后得到的液体柱来探测脑内神经递质的含量，杯内需填充含有胆碱酯酶抑制剂的溶液以防止ACh分解，否则无法检测。利用可以将cup植入到皮层的优点，Beani等(1968)首次在清醒、自由活动动物上测定ACh含量，而不仅仅是麻醉动物，发现动物行为反应的减少和脑电图的抑制均与ACh的释放减少有密切关系；反之，当动物活动增加时，伴有ACh释放的增加。Casamenti等的研究是在产生吗啡依赖的自由活动大鼠上进行的，发现吗啡耐受时皮层ACh没有变化，而纳洛酮诱发戒断时ACh含量明显增加。杯形技术的缺点一是样本收集困难和收集时间长，造成检测的灵敏度较低；二是cup只能放置在皮层表面，只能研究皮层ACh的变化，不能检测其它深部脑区ACh的含量。因此杯形技术不能研究较复杂的行为改变时脑内ACh的变化。
微透析技术：Delgado等(1972)首先提出了组织透析取样技术(Dialytrode)，后由Ungerstedt(1974)将其进一步发展，并首次报道用于自由活动动物的在体研究中。其基本原理是在透析作用下，细胞外神经递质水平与透析液中含量相一致。微透析技术不需要在透析液中加入胆碱酯酶抑制剂，尽管胆碱酯酶是高效的，但还是可以检测到细胞外液中ACh的含量。Scali等(1997)测得在平静状态下成年大鼠大脑皮层和海马透析液中ACh的含量分别是5.5±1.0和5.0±1.0 fmole/μL。为了减少样本收集时间和减少ACh的分解，也可在透析液中加入胆碱酯酶抑制剂，如果加入7μM毒扁豆碱，则皮层ACh的含量是54.5±59.2 fmole/μL。目前微透析技术已成为检测认知过程中神经递质含量的主要方法。微透析采集的样品量微、体积小，与高效液相色谱分析(High performance liquid chromatography，HPLC)结合起来能够探测细胞外各种神经递质的含量，包括ACh、胺类、腺苷、NO、多肽、氨基酸和其它内源性分子。它的优点在于不仅可以检测皮层ACh含量，还可以检测皮层下深部结构的ACh水平。
3 ACh与学习记忆
3.1 损毁胆碱能通路导致学习记忆损伤
基底前脑向皮层和海马的胆碱能纤维投射是脑内最主要的胆碱能通路。早期的研究多采用机械、药物和电损毁的方法阻断基底前脑胆碱能神经元的投射，发现损毁后随着ACh释放的减少，也可诱发记忆的损伤。Flicker(1983)和Rawlms(1982)损毁隔-海马投射导致短时记忆时目标选择的精确性和T迷宫中操作能力的降低。Casamenti(1998)的实验则选择性损毁基底核，导致皮层ACh的释放持续降低，同时伴有被动回避反应和工作记忆的降低。Kasa(1997)的实验对胆碱能系统的损毁比较完全，当广泛损毁基底前脑向皮层和海马的投射后，导致认知功能的总体水平下降甚至痴呆。因此认为脑内胆碱能系统在认知功能尤其是记忆中发挥着重要作用。近期Winters和Bussey(2005)的研究也支持上述观点。
神经免疫毒素192-IgG-Saporin可以特异性损伤核团内的胆碱能神经元，但对非胆碱能神经元没有影响。因此，利用脑内注射192-IgG-Saporin的方法，可比前述方法更具有针对性地观察脑内胆碱能系统的功能。侧脑室注射192-IgG-Saporin的行为学研究显示：只有损毁＞90％的胆碱能神经元后才可以产生比较可靠的行为学损伤，包括水迷宫任务的获得、延迟匹配任务、物体辨别获得等方面的损伤。Cahill和Baxter(2001)在基底前脑注射192-IgG-Saporin，阻断向皮层和海马的胆碱能投射，可导致皮层和海马ACh释放显著降低，并引起学习能力和策略选择
能力的降低。Ballmaier等(2002)先在双侧基底前脑注射192-IgG-saporin，并使皮层ACh释放量降低到探测水平以下，然后用胆碱酯酶抑制剂再将ACh水平恢复到正常水平，发现先前消失的前脉冲抑制现象又出现了。Chudasama等(2004)则通过用192-IgG-saporin损毁基底前脑和前额叶灌流M受体阻断剂东莨宕碱这两个途径阻断胆碱能神经元向皮层的投射，发现胆碱能系统损伤后不但造成记忆能力下降，而且对记忆的影响程度与任务类型有关，与注意状态也有密切关系。以上研究均说明由基底前脑投射至皮层和海马的胆碱能神经元在学习与记忆中发挥着至关重要的作用。
3.2 ACh与空间工作记忆
ACh是海马的主要神经递质，海马主要与工作记忆有关，尤其在空间工作记忆(Spatial workingmemory)的获得、储存和提取中发挥重要作用，海马在空间工作记忆中的作用要依赖于其胆碱能系统功能的完整性。Fadda(2000)发现在连续12天的放射状迷宫任务的学习过程中动物成绩的提高与海马的ACh增加程度成正比。Chang和Gold(2003)的研究进一步证明在空间工作记忆任务的学习过程中海马ACh升高。反之，Berger-Sweeney(2001)用免疫毒性损伤的方法选择性损毁基底前脑胆碱神经元后，小鼠执行水迷宫空间工作记忆任务的能力下降。在临床上，促进胆碱能神经传递的药物已经被用于治疗Alzheimer病人的认知损伤。最近Gr6n等(2006)的研究指出轻度认知损伤(Mild cognitiveimpairment，MCI)者认知活动能力的低下是由于其海马胆碱能神经元的功能被抑制所致，增加海马的胆碱能神经传递后，MCI者的注意、认知灵活性、口头和空间工作记忆能力均得到改善。
胆碱能神经元对空间工作记忆的调节主要通过M受体介导，并引起突触可塑性的改变。Van der Zee用免疫组化的方法研究发现空间任务辨别的学习可以选择性地增加海马CA1和CA2区的M受体数量，在皮层其它区域也观察到M受体的增加。随着空间记忆学习进程中发生的习惯化，突触可塑性也发生变化，包括突触结构和突触传递相关结构的改变。Apparsundaram等(2005)的研究发现位于突触前膜上的、负责重摄取胆碱的胆碱转运体(Cholinetransporter，CHT)受体密度在空间学习过程中逐渐增大。以上为行为功能变化的结构基础。
空间参考记忆和空间工作记忆是两个不同的记忆系统，Saar等认为空间工作记忆对东莨宕碱的反应较长时参考记忆更加敏感，空间工作记忆更加依赖于脑内M受体的功能状态。Von LinstowRoloff等(2007)进一步研究发现东莨宕碱(1mg/kg)可以严重损伤动物在延迟位置匹配任务(Delayedmatching to position，DMTP)中的空间工作记忆，甚至当剂量降至0.2mg/kg时同样损伤空间工作记忆，但是对空间参考记忆没有影响。因此东莨宕碱可以分别不同程度地干扰空间工作记忆和空间参考记忆的获得及提取过程。Chang和Gold(2003)检测脑内ACh的含量，发现在空间学习过程中海马和纹状体ACh的释放过程是不同步的，首先被激活的是海马，与空间工作记忆中的空间位置的获得有关；后被激活的是纹状体，此时海马也保持在激活状态，空间工作记忆的反应应答与两者的共同作用有关。脑内胆碱能系统从海马到纹状体的顺序激活标志着从陈述性学习到程序性学习的转换。
4 ACh与注意
关于脑内胆碱能系统对注意过程影响的研究多采用脑内损毁的方法，多数报道认为可干扰注意加工，但因为实验中注意过程很难与学习记忆等其它认知过程完全分离，所以结果极具复杂性。最早的研究是Stoehr(1997)用192-IgG-saporin损毁基底前脑胆碱能神经元，随后Chudasama等(2004)也进行了类似的研究，分别用192-IgG-saporin损毁基底前脑和用东莨宕碱灌流前额叶，观察对视空间任务的学习、记忆以及注意的影响，发现脑内胆碱能系统损毁后，根据学习任务中注意加工程度的不同，对注意和记忆产生不同的损伤，两者产生了分离。另一方面，Sarter等(2005)通过激活基底前脑至皮层的胆碱能传入可加强与记忆相关的注意加工过程。微透析检测的结果是简单操作任务时皮层ACh增加，尤其在早期获得期最显著，即需要注意加工的时期。Orsett(1996)等的研究就检测到在奖赏性操作行为的获得期皮层和海马ACh释放增加，而不是回忆期。最近Parikh(2007)进一步发现大鼠在执行视觉注意任务时，内侧前额叶皮层(Medial prefrontal cortex，mPFC)ACh释放增加。但是Passetti(2000)认为执行困难任务时的注意努力与ACh的释放之间并不是总存在对应关系。Sarter(2007)的最新研究认为刺激的注意加工过程与学习程度之间关系复杂，基底前脑胆碱能系统主要影响的是基本注意过程而不是学习；而且投射到前额叶和顶叶后部的胆碱能神经元的作用也不同，前者主要与刺激的注意加工过程有关，后者主要与学习程度有关。
5 ACh与自发活动
自发活动量(Locomotor activation)反映行为唤醒程度，关于自发活动量与ACh释放之间的直接关系的研究出现不同结果。多数研究认为动物认知过程中自发活动量的增加与ACh的升高有关。Watanabe(1990)首先发现纹状体的ACh释放与自发活动量有关，Day的研究结果也认为大脑皮层、海马和纹状体ACh的释放与自发活动量有直接关系。但是也有人不支持这种观点。Giovannini(2001)认为前脑和海马ACh释放与第一次暴露于新颖环境时的自发活动量没有关系，但是60min后动物第二次暴露于相同环境时，引起动物习惯化，此时ACh释放与自发活动量有关。可见前脑和海马ACh的释放与几个因素共同相关，自发活动量只是其中之一，其它因素如注意、唤醒、焦虑和应激等均可引起脑内ACh的释放改变。几种功能均与ACh释放有关的现象可以解释前述的矛盾结果，自发活动量与ACh释放的关系根据所研究的区域、唤醒水平、注意水平、行为表现的不同可以出现不同的结果。
Mizuno等(1991)发现海马ACh的释放规律还与觉醒一睡眠等生物节律呈现一致性。在鼠等夜行动物中，随着其夜间活动量的增加，海马ACh的释放也随之升高。Mitsushima(1998)的研究结果与其一致。如果应用基因突变的方法使大鼠的体温、自发活动量和睡眠节律较前延迟2小时，则海马ACh释放增加的出现也推迟2小时出现，说明海马
胆碱能神经元的功能受生物节律的调节。最近Takase(2007)等用微透析方法24小时同时检测运动前区ACh的释放、基底大细胞核(Nucleus basalis magnocellularis，NBM)胆碱能神经元的数量以及自发活动量这三个指标，以进一步确定三者之间的关系。发现ACh释放呈现24小时节律，夜间高白天低，与自发活动量的变化保持同步，进一步验证了Mizuno的结果。另外他们首次报道ACh的释放还表现出性别差异，雌性大鼠较雄性ACh释放量更大而且NBM核的神经元数量也更多，因此认为运动前区ACh的释放与运动的性别差异有关。
6 ACh与探究行为
关于前脑和海马的胆碱能神经元与新颖环境下探究行为的关系首先得到电生理学研究的证实。Gray和McNaughton(1983)记录到动物处于新颖环境下时，海马神经元出现e节律，而海马e节律是皮层一海马胆碱能通路被激活的表现。在行为学研究方面，Inglis和Fibiger(1995)指出视觉、嗅觉、听觉和触觉等方面的新颖刺激均可增加皮层和海马ACh的释放并引发一系列相应的行为改变，而且各种刺激引起的海马ACh升高程度是相同的，并不具有特异性。因此胆碱能递质系统的改变是对各种新颖刺激发生的反应，并不是针对不同的刺激类型。Acquas(1996)进一步研究了刺激和胆碱能系统反应的关系，发现在恐惧条件反射形成实验中，当用声音和光线刺激作为条件刺激时，可显著增加ACh在额叶皮层和海马的释放。但当反复给予声音和噪音刺激8天并使动物形成习惯化后，不再引起ACh释放的增加。Giovannini(2001)着重比较新颖性高低引起ACh改变的不同：如果动物在新颖环境中仅仅停留2rain，则皮层ACh增加150％～200％：停留时间超过30min，则皮层ACh增加幅度下降。另外，第一次暴露在新颖环境时，皮层和海马ACh的释放分别增加64％和200％；而第二次处于新颖环境时，皮层和海马ACh的释放增加分别降至37％和51％。Bianchi和Giovarmini(2003)在前述基础上进一步观察了其它递质系统与新环境中探索行为之间的关系，发现当大鼠第一次暴露于新颖环境时，前10min内海马除了ACh升高以外，谷氨酸、天门冬氨酸也较前升高，GABA则在10min后开始升高。而第二次处于相同环境时，各种递质水平的升高均较前降低。因此新环境中的探究行为受ACh、谷氨酸、天门冬氨酸和GABA递质系统的协同调节。
反之，Ricceri(2003)用192-IgG-saporin损伤新生大鼠胆碱能系统，大鼠成年后在空间新环境下的探索能力下降。Michael(2007)最近具体研究了海马CA3区至隔区的投射和隔区至海马CA3区胆碱能投射之间的关系，结果是CA3区灌流东莨宕碱后，动物在空间和非空间新环境下的探索能力均下降，选择性切断CA3区至隔区的传出纤维，也得到类似结果；相反灌流胆碱酯酶抑制剂毒扁豆碱则使之增强。说明胆碱能系统调节海马的信息编码、储存、提取过程，并且CA3区和隔区存在相互作用，CA3区通过影响隔区投射至海马的胆碱能传入来调节信息编码。
除了环境因素，新的味觉刺激也可引起岛叶ACh的释放增加。已经证实岛叶在味觉信息的编码过程中有重要作用，应用东莨宕碱阻断岛叶的M受体可阻断对味觉的编码。Miranda等(2000)在大鼠的饮水中加入糖精，当第三次给予时岛叶ACh的释放不再增加，当用奎宁代替糖精作为新颖刺激时，又出现新的ACh释放高峰。但这个实验没有确定是否味觉也可以激活海马及其他皮层区域ACh的释放，而不仅仅是在味觉代表区。
7 小结
综上所述，脑内ACh与认知活动之间关系复杂。在学习与记忆、注意、新环境下的探究行为和自发活动等各种认知活动中，脑内ACh多呈现同步升高的趋势，但是也有不同的结果。各种认知活动中脑内ACh的改变主要表现在皮层、海马等脑区，它们主要接受来自基底前脑的胆碱能纤维投射。虽然不同的认知活动也可以引起某些特定相关脑区ACh的升高，但是这方面的研究证据尚不充分。另外，脑内ACh的改变还与认知过程中不同的信息加工环节和模式有关。
目前在研究清醒、自由活动动物ACh的动态含量时方法学上尚存在一定限制。因为微透析技术应用高压液相分析脑内ACh的含量时需要的采集时间是5rain，但认知活动中信息的获得和行为的改变通常发生在数秒内，在5min的透析液收集期间所发生的一切是无法全部探测到的。这种时间上的差距造成无法精确确定脑内ACh变化和特定认知活动之间的动态对应关系。
尽管研究者们从不同的角度对脑内ACh与认知活动的交互关系进行了考察，但这些研究彼此之间并不是完全独立的，而是彼此之间有着密切的联系，对一些问题的探讨也往往伴随着另一些基本问题的探讨，如在ACh与学习记忆关系的研究中，实际上往往涉及到了注意、新环境刺激等对ACh的影响。因此在今后的研究中一个可行的研究方向是将这些相关的问题有机地结合起来进行研究，进而揭示ACh与认知活动关系的实质。