树突状细胞的培养与鉴定

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【摘要】 目的 研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子GM-CSF和IL-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, DCs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的DCs的培养方法。方法 通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。在细胞因子GM-CSF和IL-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。 结果 在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。流式分析发现细胞高表达DC表面特异性抗原CD80，CD86，HLA-DR，并且不再表达单核细胞表面抗原CD14，细胞纯度约为93.12%。淋巴细胞增殖实验显示DCs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。 结论 通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用GM-CSF和IL-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。

【关键词】 树突状细胞；磁珠；流式

Molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes.

【Abstract】 Objectives：To develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (DCs) from highly purified CD14 + monocytes from human peripheral blood. Methods：Monocytes were purified by negatively sorting peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with dynal magnetic negative isolation kit. Monocytes were then differentiated into immature dendritic cells stimulated by the combination of interleukin-4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factors (GM-CSF) for 7days. Cells were analyzed for phenotype by flow cytometry。Allogenic lymphocyte proliferation assay was done by mixing dendritic cells with nave cord blood mononuclear cells and then coculture for 4 days. Results：Upon culture with GM-CSF plus IL-4, CD14+ cells rapidly became non-adherent clustered, developed into a morphologically homogeneous cell population with different extents of veiled morphology. Analysis of surface markers showed that the cells became CD14－ and expressed high levels of HLA-DR、CD80、CD86, and CD40. Cells showed high capacity of stimulating nave lymphocytes to proliferate. Conclusions: FACs analysis and functional capacity identified the cells with typical veils as dendritic cells.

【Key words】 Dendritic cell, magnetic, flow cytometry

树突状细胞（Dendritic cells， DCs）是免疫系统中强有力的免疫调控细胞(Banchereau,1998)。随着树突状细胞在基因治疗及免疫治疗的应用，以及人们对免疫反应机制的不断探索研究，树突状细胞的分离、纯化、培养与鉴定技术也得到了飞速的发展。目前国内实验室在如何在体外培养出高质量的DCs的技术依然很欠缺。本研究在国外一些研究的基础上，经过改进探索了一套较成熟、简单、高效的培养树突状细胞的方法，并通过细胞形态、表型、功能等方面鉴定细胞为树突状细胞，为今后这方面的实验研究提供一条可供选择的技术方法。

1 材料与方法

1.1 树突状细胞的培养 取20ml左右的新鲜分离的白细胞悬液（武汉市中心血站），与PBS（PH=7.2）等体积混合，利用Ficoll-paque plus (Amersham Biosciences)密度梯度离心分离得到单个核细胞，约3×107/ml，利用Dynal单核细胞磁珠分离试剂盒(Dynal Biotech)，得到高纯度单核细胞，重悬于加入20％FCS(Gibco）的RPMI-1640 (Gibco）培养基中，调整密度至5×105/ml，接种六孔板中（BD corporation），加入rhGM-CSF (R&D)终浓度50ng/ml， IL-4（R&D）终浓度20ng/ml，隔天半量换液，37℃5％CO2，培养至5天左右，加入TNF-α100ng/ml（Peprotech），培养第7－8天收获悬浮细胞。

1.2 流式细胞术分析单核细胞和树突状细胞的表型 收集磁珠分选后的细胞悬液，调整细胞密度并分别加入20μl PE mouse IgG1K isotype control以及PE-anti human CD14抗体，4℃避光孵育45min，PBS洗涤两次，1％多聚甲醛固定，流式细胞仪分析。

收集培养至7-8天左右细胞，分别加入PE标记的鼠抗人CD14，抗人HLA-DR，抗人CD80，抗人CD86单克隆抗体（Ebioscience），PE标记的鼠的同型对照抗体， 4℃避光孵育45min后，PBS洗两次，1%多聚甲醛固定，流式细胞仪检测细胞表型。

1.3 淋巴细胞增殖反应 收集新生儿脐带血，利用Ficoll-paque plus密度梯度离心的方法获得新生儿单个核细胞。将培养至7天的树突状细胞用完全培养基悬浮后密度为1×105细胞/ml，加入丝裂霉素C25μg/ml，37℃孵育45分钟，PBS洗3次，用完全培养基再次悬浮，以3×104/孔， 1.5×104/孔，7.5×103/孔，3.75×103/孔，1.875×103/孔， 9.375×102/孔，2.35×102/孔密度加入96孔圆底培养板，每个浓度设置3个孔，加反应细胞即方法相同新生儿单个核细胞悬液，5×104/ml，100μl/孔。37℃5％CO2浓培养4天，每孔加入5mg/ml的MTT10μl，继续培养4h， 离心，甩去上清，加入DMSO150μl/孔，轻轻振荡，待结晶完全溶解10min，酶联免疫检测仪于570nm处检测并记录结果，同时设有空白对照。

2 结果

2.1 单核细胞的分离与树突状细胞的培养 倒置显微镜下观察，磁珠分离得到的单核细胞圆形均质，悬浮，细胞纯度大于90％。在加入细胞因子GM-CSF和IL-4后，细胞培养第二天可见悬浮的细胞簇。培养第3-4天，可见部分细胞出现毛刺样的突起，培养至第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起，如图1所示。

图一：典型的树突状细胞（×40）

2.2 细胞表型 流式细胞仪对新鲜分离的单核细胞以及培养至第7天的树突状细胞表面抗原进行分析，检测细胞表面CD14、CD80、CD86、HLA-DR等分子的表达情况。结果显示新鲜分离的单核细胞高表达细胞抗原CD14，而培养至第7天的树突状细胞表面出现特异性抗原CD1a、CD80、CD86、HLA-DR, 而不再表达单核细胞抗原CD14，结果如图二所示。

2.3 淋巴细胞增殖反应 新生儿脐带血中含有大量的初始型T淋巴细胞，仅树突状细胞可以刺激初始型T淋巴细胞增殖(Sallusto，1994)。细胞在树突状细胞作用4天后，数量明显增加（如图三所示）.

3 讨论

抗原递呈细胞始动和调节免疫反应的发生，尤其是DCs在针对外来抗原的初始免疫反应中发挥关键作用（Banchereau，1998； Sumida，2004）。越来越多的研究显示DCs由于表皮LC细胞的分离培养过程复杂，细胞数量有限，而血液中的DCs含量也极少，直接分离存在很大困难。因此，我们采用分离DCs前体细胞即单核细胞的方法，在细胞因子诱导下培养DCs，这一方法操作相对简便，技术较成熟，且细胞保持体内未成熟DCs摄取加工抗原的特性，具有典型的突起，高表达MHCⅠ和MHCⅡ分子。

研究表明，从单核细胞诱导分化而来的DCs主要具备以下特点（Salluato F，1994）：1）典型的细胞形态和细胞的活动性；2）细胞的表型，高表达CD1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、Ii、FcμRⅡ、B7、CD40、ICAM-1、LFA-3、CD11c；3) 刺激初始型T细胞增殖能力强，DCs是唯一可以激活脐带血T细胞增殖的抗原递呈细胞。因此，对树突状细胞的鉴定主要从这三个方面来进行。

经GM-CSF、IL-4共同培养的DCs是高度同质性的一群细胞，细胞的大小，形态，表型高度一致，方便实验研究，但是体外培养的DCs与体内的DCs还是具有这明显的差别。研究发现，体外培养的DC具有MPO蛋白，并表达LZ和M-CSFR。但这些标志并不经常在体内的DCs如朗格汉斯细胞及淋巴系DC检测到（Pickl，1996），并且有实验证实皮肤DCs即LCs从体内分离后，短时间体外培养，表型会发生明显改变（Victor，2001）。另外，细胞因子的质量在DCs培养过程中作用尤其重要，RD公司的细胞因子质量最好，有研究表明RD公司的IL-4浓度为5ng/ml就可诱导单核细胞分化。本研究经过多次实验发现GM-CSF终浓度50ng/ml，IL-4终浓度25ng/ml可起到较好的效果。

参考文献

［1］Banchereau Jacques, Steinman RM. Dendritic cell and the control of Immunity Nature, 1998，392(19): 245-252.

［2］Sallusto F，Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.1994,179 (4):1109-18.

［3］Sumida SM, McKay PF, Truitt DM, et al. Recruitment and expansion of dendritic cells in vivo potentiate the immunogenicity of plasmid DNA vaccines. Clin Invest, 2004, 114:1334-1342.

［4］Pickl WF, MajdicO, Kohl P, et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes. J Immunol, 1996, 157(9): 3850-9.

［5］Victor PC, Susumu Ito, Mohamed Qukka, et al. Extraction of human Langerhans cells: a method for isolation of epidermis-resident dendritic cells. J Immunol Methods. 2001, 255(1-2): 83-91.