大鼠皮肤成纤维细胞分离培养方法的研究
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摘要：目的：对大鼠皮肤成纤维细胞进行分离培养并观察形态。方法：组织块培养法分离大鼠成纤维细胞并进行传代培养并通过细胞形态学观察和HE染色对其细胞进行鉴定。结果体外培养的成纤维细胞呈梭形或多角形，24小时贴壁，通过HE染色，细胞核被染成蓝紫色，胞浆被染成粉红色。结论：该方法成功培养了大鼠背部皮肤的成纤维细胞，所获得的大鼠背部皮肤成纤维细胞可在体外稳定培养，为一些组织来源较少的成纤维细胞培养提供一种有效且可行的实验方法。
关键词：大鼠；成纤维细胞；体外培养
中图分类号： R329.2 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/ki.jlny.2014.23.0019
成纤维细胞是真皮组织的主要组成成分，在构建人工皮肤和组织创伤修复中发挥着重要作用，对成纤维细胞的培养研究已经为细胞水平上研究伤口愈合的机制提供了有力工具[1]。本文旨在探索组织块培养法进行大鼠成纤维细胞分离和体外培养。
1 材料与方法
1.1 材料、仪器及试剂
新出生SD大鼠、超净工作台、超低温冰箱、CO2培养箱、眼科剪、培养瓶、离心管、尼龙纱网、乙醇、PBS溶液、新生牛血清、DMEM培养液、中性蛋白酶、胰蛋白酶、血球计数板。
1.2 实验方法
1.2.1 成纤维细胞的分离与培养 取新出生的SD大鼠，断颈处死，在75%乙醇中浸泡3～5分钟。在无菌条件下，剪取鼠背部皮肤。去除皮下组织，PBS溶液反复漂洗后，将组织块剪切成约1立方毫米的小块，0.25%中性蛋白酶在4℃处理12～16小时，去除表皮，将剩余的真皮组织以0.3～0.5毫米间距接种于培养瓶内壁，加入少量DMEM培养液，置入5% CO2， 37℃的CO2培养箱中培养24小时，待组织块吸附牢固后，次日补加培养液至正常体积，三天后换液。当成纤维细胞汇合成片，占培养瓶底面的80%左右时，加入PBS溶液洗涤2次，加入少量0.25%胰蛋白酶覆盖瓶底，消化3～5分钟，当细胞间隙变大，胞质回缩时，加入含有小牛血清的培养基终止消化，由上至下，由左至右吹打瓶壁，细胞脱落后，以1200转/分钟离心5分钟，弃上清加入10%小牛血清的DMEM培养基重悬，台盼蓝染色进行细胞计数，按照8×104密度接种培养。当细胞培养至第5代，第10代分别进行常规冻存，以便需要时复苏。
1.2.2 HE染色 细胞爬片，PBS洗涤，95%酒精固定，PBS洗涤，浸入苏木精染液，自来水浸洗；浸入稀盐酸酒精溶液分色，自来水浸洗；浸入淡氨水，使胞核蓝化，自来水浸洗；浸入伊红染液，自来水浸洗；逐级脱水，二甲苯透明，滴加中性树胶，封固，镜下观察。
2 结果与分析
2.1 观察体外培养的细胞
接种后，4小时左右开始贴壁生长，1～3天游离出的细胞开始贴壁，细胞变为梭形。随着时间延长，原代培养的细胞汇合成片，7天后长满单层，细胞伸展呈现梭形和多边形，体积变大，细胞中央有卵圆形的细胞核，胞质向外伸出2～3个不规则的生长突。细胞在生长时总体呈放射火焰状或旋涡状生长。
2.2 HE染色观察
经过HE染色的细胞，形状为多角形或长梭形，可见细胞核位于细胞的中央， 细胞核被染成淡蓝色，细胞质被染成粉红色。
3 讨论
成纤维细胞是真皮组织的主要构成细胞，不仅可以合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白等多种细胞外成分，还可以分泌一些重要的细胞因子[2]。原代培养常采用酶消化法，但步骤多，过程复杂，并且酶本身对细胞贴壁有一定影响，多次离心也会导致细胞收到损伤和数量丢失，组织块培养法相对酶消化法步骤简单，容易掌握，操作过程中不易发生污染，细胞成活率高，简单易行[3]。本实验将酶消化法和组织块法二者结合，使用了温和的中性蛋白酶，可以将表皮与真皮之间的连接断开，避免了在细胞培养时混杂有表皮细胞对其生长的干扰，组织块法对真皮组织进行培养，最大限度地保留了组织中各种生长因子的活性，保留了其对细胞增殖的促进作用。组织块中含有大量的生长因子，这些生长因子游离出来释放到培养基中，对细胞的体外生长起积极作用[4]。本实验分离培养的成纤维细胞绝大多数呈长梭形，胞体细长，有2～3个胞突，细胞折光性强，活力强，HE染色后核质明显，具有成纤维细胞典型的形态学特征。充分证明该方法培养的成纤维细胞活力强，细胞损失少，且纯化效果好，对于一些组织来源较少的成纤维细胞培养提供一种有效且可行的实验方法。
参考文献
[1] 陈世义，马刚，于海滨，等.人工真皮成纤维细胞的分离培养与鉴定[J].吉林大学学报，2002，28 （4） ：437-438.
[2] 李常，葛正行，李波，等.大鼠气道成纤维细胞的分离、培养及鉴定[J].吉林医学杂志.2012， 8 （19） ：3-4.
[3] 李海红，周岗，付小兵，等.人皮肤成纤维细胞的培养和鉴定[J].中国危重病急救医学，2005，17 （2） ： 89-91.
[4] 王艳.MDA-7基因的腺病毒载体构建及其肿瘤靶向治疗的实验研究， [D].江苏大学，2008.
作者简介：冯颖，硕士，通化师范学院生命科学学院，讲师，研究方向：生物技术。