GVHD移植研究论文
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摘要】本研究观察激活的供、受者NK细胞能否减轻骨髓移植后gvhd和增加移植成活率。以C57BL/6小鼠作为供者，将接受6.5Gy60COγ射线全身照射的BALB/c受鼠随机分为4组，对照1组（无任何处理）、对照2组（骨髓移植）、实验1组（骨髓移植同时输注激活的受者NK细胞）和实验2组（骨髓移植同时输注激活的供者NK细胞），观察每组小鼠的活存期、嵌合率、GVHD临床和病理改变。结果表明：对照1组全部活存，实验1组比对照2组活存期短（P<0.05），实验2组比对照2组活存期延长（P<0.01）。实验1组GVHD临床及病理评分高于对照2组（P<0.05），实验2组GVHD临床及病理评分明显低于对照2组（P<0.01）。实验1组和实验2组嵌合率均较对照2组高（P<0.05），实验2组的嵌合率比实验1组明显增加（P<0.01）。结论：激活的供者NK细胞能延长实验小鼠的活存期，降低GVHD严重程度，增加移植成活率；而激活的受者NK细胞却缩短实验小鼠的活存期，加重GVHD严重程度。受者NK细胞也增加移植成活率，但比供者NK细胞作用小。
【关键词】骨髓移植;NK细胞;GVHD;移植成活率
ExperimentalStudyofDonorNaturalKillerCellsReducingGraft-versus-hostDiseaseandEnhancingEngraftment
AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatewhetherpretransplantinfusionofreactivenaturalkillercells（NKcells）fromdonororrecipientcanreducegraft-versus-hostdisease（GVHD）andenhanceengraftmentinbonemarrowtransplantation（BMT）.RecipientBALB/cmiceweredividedinto4groupsafterreceived6.5Gytotal-bodyirradiation(TBI):controlgroup1wastreatedwithnothing,controlgroup2receivedBMTalone,experimentgroup1receivedBMTandautoreactiveNKcells,experimentgroup2receivedBMTandalloreactiveNKcells.Lifespan,clinicalandpathologicchangesofGVHDandchimerismrateofeachgroupwereevaluated.Theresultsshowedthatallmiceweresurvivalincontrolgroup1.Thelifespanwasshorterinexperimentgroup1thanthatincontrolgroup2（P<0.05）andlongerinexperimentgroup2thanthatincontrolgroup2（P<0.01）.GVHDwashigherinscoreofexperimentgroup1thanincontrolgroup2（P<0.05）butlowerinexperimentgroup2thanthatincontrolgroup2（P<0.01）.Thedonorchimerismrateinbothtwoexperimentgroupswerehigherthanthatincontrolgroup2（P<0.05）,however,thedonorchimerismratewashigherinexperimentgroup2thanthatinexperimentgroup1（P<0.01）.ItisconcludedthatpretransplantinfusionofalloreactivedonorNKcellscanprolonglifespan,reducethedegreeofGVHDandenhanceengraftment.ButautoreactiverecipientNKcellscanshortenlifespan,aggravatethedegreeofGVHDandalsoenhanceengraftment,whichisweakerthanthatusingalloreactivedonorNKcells.
Keywordsbonemarrowtransplantation;naturalkillercell;GVHD;engraftment
骨髓移植是目前根治恶性血液肿瘤的主要方法，但其主要致死性并发症——移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease,GVHD）却制约着其应用。回顾性研究发现,在骨髓移植中受者体内天然杀伤细胞（naturalkillercells,NK）增加的同时GVHD发生率降低，移植成活率增加，复发率减少［1］。我们利用动物模型分别研究了供、受者来源的NK细胞能否减轻GVHD和增加移植成活率，探索NK细胞在骨髓移植中的应用及机制。
材料和方法
实验动物
C57BL/6（H-2b）小鼠作为供者，BALB/c（H-2d）小鼠作为受者，均为雄性，鼠龄8周，体重18-20g，均为清洁级动物（四川大学华西校区实验动物中心提供和饲养）。
实验分组
将接受6.5Gy60COγ射线全身照射的BALB/c受鼠随机分为4组：对照1组（不予以任何处理）、对照2组（予以骨髓移植）、实验1组（骨髓移植同时输注激活的受者NK细胞），实验2组（骨髓移植同时输注激活的供者NK细胞）。每组用10只小鼠观察生存期和GVHD，用20只小鼠检测嵌合率。
NK细胞分离、纯化、检测及体外活化
分别取供、受鼠脾脏和骨髓细胞，用抗CD49b（DX5）MicroBeads（MiltenyiBiotec公司产品）分离NK细胞，用rhIL-2体外培养及激活，标记CD49b抗体（BioLegend公司产品），用流式细胞仪（Coulter公司产品）检测NK细胞含量。LAC-1细胞作为靶细胞，MTT法检测培养后的NK细胞杀伤活性。
小鼠骨髓移植模型
参照Ruggeri等［2］的方法，各组受鼠在移植前饮用含庆大霉素灭菌水（32×104U/L），移植前1天行亚致死剂量60COγ射线全身照射（TBI6.5Gy）。照射后4小时在无菌条件下，用头皮针沿受鼠鼠尾静脉输注含量大于90%、活细胞数大于95%、杀伤活性大于90％的NK细胞（5×105/只）。照射后1天，无菌条件下摘眼处死供鼠，取股骨，用无菌培养液冲洗骨髓腔，收集细胞冲洗液，溶解红细胞后，作为移植的骨髓细胞。取供鼠脾脏，研磨后用200目筛网制成单个细胞悬液，溶解红细胞后，作为输注的供鼠淋巴细胞。在无菌条件下，用头皮针沿受鼠鼠尾静脉输注供鼠骨髓细胞（1×107/只）和供鼠淋巴细胞（1×107/只）。术后于二级动物房层流床饲养。
存活期和GVHD临床表现的观察
活存超过30天为长期活存［3］。移植后，每周称重1次，观察小鼠有无体重下降、腹泻和脱毛，有无弓背、耸毛、活动度差等精神表现。GVHD临床评分（0-10分）由体重下降、活动度、姿势、耸毛、皮肤溃疡5项相加组成。体重下降＜10％为0分，下降10％-25％为1分，下降＞25％为2分。无活动度下降、姿势异常、耸毛为0分，轻度活动度下降、耸毛、姿势异常判为1分，重度活动度下降、耸毛、姿势呈弓背样改变为2分。皮肤完整无脱毛为0分，小片浅溃疡、轻度溃疡为1分，大片溃疡、脱毛为2分［4］。
GVHD病理学观察
对死亡小鼠及活存超过30天处死的小鼠，取肝、脾、肠和皮肤组织，用4％的多聚甲醛液固定，石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察。GVHD病理评分标准（0-10分）：肝脏根据汇管区有无淋巴细胞浸润、胆管有无炎症、阻塞分为Ⅰ-Ⅴ级；小肠按有无隐窝细胞坏死、粘膜缺失分为Ⅰ-Ⅴ级［5］。
嵌合体检查
从死亡小鼠以及移植前和移植后1、2、3、4周各组处死的小鼠中，取出脾脏并研磨，溶解去掉红细胞。用FITC连接的供鼠MHCⅠ单克隆抗体（H-Kb抗体）和PE连接的受鼠MHCⅠ单克隆抗体（H-Kd抗体）标记，上流式细胞仪检测嵌合率。
统计学分析
采用SPSS10.0统计软件包处理，计量资料用均数±标准差（X±SD）表示，计数资料用百分率（％）表示。用单因素方差分析（one-wayANOVA）对各组均数作显著性检验，如多组比较有显著性差异，进一步采用Student-Newmen-Keulstest作各样本之间的两两比较。等级资料用秩和检验。对小鼠生存期绘制Kaplan-Meier存活曲线，用时序检验和log-ranktest检验比较生存期及死亡率。
结果
生存期及死亡率观察
对照1组全部存活，对照2组、实验1组、实验2组存活期分别为25.6±1.2天、19.4±1.8天和33.7±1.5天，30天死亡率分别为100％、100％和20％。各组Kaplan-Meier生存率曲线见图1。实验2组和对照2组差异显著（χ2＝13.5，P＝0.0002）。实验1组和对照2组差异显著（χ2＝4.94，P＝0.03）。
GVHD临床表现
对照1组没有GVHD临床表现。对照2组和实验1组出现明显GVHD临床表现：体重下降明显（下降10％-25％）、活动度降低、弓背、耸毛、脱毛、腹泻等现象，评分分别为7.2±1.3和8.5±1.0分；两组比较有差异（H值＝-2.09，P＝0.037）。实验2组GVHD出现晚（25天后才出现）、程度轻，表现为轻度体重下降（下降<10％）、轻度脱毛和弓背，活动度轻度降低，没有腹泻，评分3.1±1.2分，与对照2组比较有显著差异（H值=-3.766，P=0.0000）（表1）。Table1.ScoredseverityofGVHDmanifestationingroups(略)
GVHD病理表现
对照1组小鼠肝、脾、肠和皮肤组织均正常。对照2组和实验1组小鼠肝脏结构被破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞弥漫性大片坏死，中央静脉和肝血窦扩张、淤血，胆小管增生、淤胆，坏死区由增生的结缔组织所取代，伴大量枯否氏细胞和淋巴细胞浸润。小肠粘膜层被覆上皮坏死脱落，为一层红染的坏死组织、变性的白细胞和纤维素交织成的假膜所覆盖；粘膜和粘膜下层明显水肿、充血，伴大量淋巴细胞浸润。脾脏萎缩，正常结构破坏，有巨噬细胞和淋巴细胞浸润。皮肤结构破坏，局部有淋巴细胞浸润，有纤维细胞增生。评分分别7.5±1.1和8.8±1.0分，两组比较有差异（H值为-2.330，P＝0.020）。实验2组小鼠肝细胞排列整齐，形态完整，肝血窦和汇管区有少量枯否氏细胞和淋巴细胞浸润，中央静脉轻度淤血。小肠各层结构完整，没有坏死脱落，粘膜和粘膜下层伴少量淋巴细胞浸润。脾脏结构正常，没有巨噬细胞和淋巴细胞浸润。皮肤仅见真皮层毛细血管轻度扩张，未见淋巴细胞浸润。评分2.5±1.1分，与对照2组比较差异显著（H值为-3.808，P＝0.0000）(表2和图2)。Table2.ScoredseverityofGVHDpathologyfeatureingroups(略)
嵌合体检查
对照1组没有供者嵌合体，对照2组、实验1组、实验2组在第2周供者嵌合率最高，分别为63.2％、81.7％、96.4％，以后逐渐下降，第4周供者嵌合率分别为3.7％、29.4％、52％（P<0.05）（图3）。
讨论
单纯照射组全部存活，说明我们使用的是亚致死剂量照射，实验动物均能耐受预处理，其他组小鼠死亡可以排除照射原因。由于没有移植供鼠骨髓，单纯照射组病理检测无GVHD改变，也没有供者嵌合体。我们采用骨髓移植联合输注供鼠淋巴细胞，在单纯骨髓移植组均出现了严重的GVHD临床和病理改变，构建了异基因骨髓移植GVHD模型；由于使用的是亚致死剂量照射预处理，其嵌合率最高为63.2％，4周时下降到3.7％，移植物被排斥。该模型被用于进一步研究NK细胞对GVHD的作用。输入激活的供者NK细胞能克服移植物被排斥，使嵌合率高达96.4％，4周时保持52％，增加了移植成活率。同时GVHD并没有加重，反而明显减轻，从7.2分降到3.1分，生存期从25.6天延长到33.7天，该结果与国外研究结果一致［2］，说明激活的供者NK细胞能延长生存期，降低GVHD临床及病理程度，增加嵌合率，为临床减少GVHD和提高移植成活率提供了切实可行的新思路和新方法。NK细胞具有两种不同的受体，一种是激活NK细胞杀伤作用的受体（KAR），另一种是抑制NK细胞杀伤作用的受体（KIR）。如果KIR与其配体MHCⅠ不匹配，NK细胞将破坏含有这种配体的细胞［6］。我们使用C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）两个不同品系的近交系小鼠，它们的NK细胞KIR基因和MHCⅠ基因是不同的，供鼠KIR与受鼠MHCⅠ不匹配，供鼠NK细胞会杀伤受者细胞，比如杀伤受者抗原递呈细胞等。因为自体NK细胞和自身MHCⅠ是匹配的，不会杀死自身细胞，所以我们将自体NK细胞设为异体NK细胞的对照。结果激活的自体NK细胞加重GVHD，小鼠死亡时间从25.6天缩短到19.4天，但嵌合率却增加，对此，目前还没有类似结果报道。这些结果不能完全用KIR-MHCⅠ的匹配关系解释。是否自体NK细胞激活后其KAR功能和活性发生了变化，KAR杀伤作用远远大于KIR的抑制作用，误杀了自身正常组织，从而加重GVHD。有报道体外NK细胞能溶解同源性未成熟树突状细胞（iDC）［7］，由于iDC起免疫抑制作用，自体NK细胞溶解自体iDC，也可以解释自体NK细胞加重GVHD。我们的研究结果显示，采用供鼠激活的NK细胞能够减轻急性GVHD的严重程度，并且促进供鼠骨髓植入。其原理可能与供鼠NK细胞对受鼠体内抗原呈递细胞、淋巴细胞、吞噬细胞的杀伤和抑制作用有关，供鼠NK细胞在GVHD发病中对抗原识别和细胞效应阶段的这种生物调控作用，值得进一步深入研究。
【参考文献】
1DaviesSM,RuggieriL,DeForT,etal.EvaluationofKIRligandincompatibilityinmismatchedunrelateddonorhematopoietictransplants.Blood,2002;100:3825-3827
2RuggeriL,CapanniM,UrbaniE,etal.Effectivenessofdonornaturalkillercellalloreactivityinmismatchedhematopoietictransplants.Science,2002;295:2097-2100
3段连宁，郭坤元，袁进等．同种异基因Th2细胞移植对GVHD和GVL效应的作用.中国实验血液学杂志,2000;8：57-60
4BrysonJS,JenningsCD,LoweryDM,etal.RejectionofanMHCclassIInegativetumorfollowinginductionofmurinesyngeneicgraft-versus-hostdisease.BoneMarrowTransplant,1999;23:363-72
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6YoungNT.Immunobiologyofnaturalkillerlymphocytesintransplantation.Transplantation,2004;15,78:1-6
7CooperMA,FehnigerTA,FuchsA,etal.NkcellandDCinteractions.TrendsImmunol,2004;25:47-52.