氯沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导巨噬细胞MMP-9表达的影响

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[摘要] 目的：探讨氯沙坦对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导巨噬细胞mmp-9表达的影响。方法：体外培养巨噬细胞，测定AngⅡ诱导巨噬细胞MMP-9表达及氯沙坦的干预作用。结果：AngⅡ组MMP-9表达明显高于对照组(P

[关键词] 氯沙坦；血管紧张素Ⅱ；基质金属蛋白酶

[中图分类号]R96 [文献标识码]C [文章编号]1673-7210（2008）06（c）-182-02

Impact of losartan on matrix metalloproteinase-9 expression in macrophage of angiotensin Ⅱ-induced

MA Yi

(Shandong Institute of Light Industry, Jinan 250353,China)

[Abstract] Objective:To study the impact of losartan on matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) expression in macrophage of angiotensin Ⅱ-induced. Methods:To observe MMP-9 expression of angiotensin Ⅱ-induced in macrophage to culture in vitro and the role of losartan. Results:MMP-9 expression in angiotensin Ⅱ group was significantly higher than that in control group(P

[Key words] Losartan; Angiotensin Ⅱ; Matrix metalloproteinase

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)参与动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发生、发展过程[1]。AS是由单核细胞/巨噬细胞及T淋巴细胞参与的一种炎症疾病[2]。单核/巨噬细胞浸润、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)增加是动脉粥样硬化斑块(atherosclerotic plaque)不稳定的重要因素。为此，本实验探讨了血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)诱导巨噬细胞MMP-9表达的变化及氯沙坦的干预作用。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

人急性白血病单核细胞系(THP-1细胞)（协和干细胞基因工程公司）；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；RPMI-1640和Trizol抽提试剂(Gibco BRL公司)；佛波酯(PMA)和AngⅡ(Sigma公司)；氯沙坦（美国MSD医药公司惠赠）。逆转录试剂盒(Fermentas公司)；PCR引物及试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；人MMP-9 ELISA试剂盒(ADL公司)。

1.2 细胞培养

将THP-1细胞置含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，于37℃、5% CO2培养箱中孵育，2~3代后用于实验。先用含120 μg/L PMA的RMPI-1640培养液诱导THP-1细胞转化，72 h后细胞分化为巨噬细胞。无血清培养基充分洗涤，继续培养24 h后开始实验。

1.3 体外诱导及药物干预

① 体外诱导：巨噬细胞分别以1×106~1×109 mol/L AngⅡ体外诱导24 h；同时设不含AngⅡ作为空白对照。② 药物干预：AngⅡ组巨噬细胞以1×107 mol/L AngⅡ诱导；氯沙坦组巨噬细胞以1×105 mol/L氯沙坦作用0.5 h；氯沙坦+AngⅡ组巨噬细胞以1×105 mol/L氯沙坦作用0.5 h后再加入1×107 mol/L AngⅡ诱导；同时设不含AngⅡ和氯沙坦作为空白对照组；各组均孵育6 h。

1.4检测MMP-9表达水平

① 逆转录聚合酶链反应(RT-polymerase chain reaction, RT-PCR)法：提取细胞总RNA，反转录成cDNA，以β-actin为内对照进行半定量RT-PCR测定MMP-9 mRNA表达量。MMP-9的上游引物：5′-GATGCGTGGAGAGTCGAAATC-3′，下游引物：5′-CACCAAACTGGATGACGATG-3′，扩增产物为337 bp；β-actin的上游引物：5′-GTACCACTGGCATCGTGATG-3′，下游引物：5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′，扩增产物为449 bp。MMP-9的扩增条件：94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35个循环。PCR产物5 μl置2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照，对电泳带进行吸光度扫描，以MMP-9/β- actin比值代表MMP-9 mRNA的相对表达量。②酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法：收集细胞上清液，ELISA法测定MMP-9蛋白的表达。

1.5 统计学处理

应用SPSS11.5软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析，P

2 结果

2.1 AngⅡ对巨噬细胞MMP-9表达的作用

AngⅡ组诱导巨噬细胞MMP-9表达高于对照组(P

2.2 氯沙坦对AngⅡ诱导巨噬细胞MMP-9表达的影响

AngⅡ组MMP-9表达明显高于对照组(P

3 讨论

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一类生物活性依赖于锌离子、有降解细胞外基质(extracellar matrix, ECM)能力的内肽酶家族。迄今为止，人类中已识别和定性的MMPs有23种[3]，主要分为胶原酶、明胶酶、基质溶解素及膜型MMPs(MT-MMPs)。明胶酶包括明胶酶A(MMP-2)和B(MMP-9)，两种明胶酶均具有降解间质蛋白的能力[4]。血管外向性重构的触发机制是为适应血流剪切力和管壁张力所作出的生理性反应。MMPs通过解除管壁ECM结构骨架的束缚而参与此过程。AS大鼠平滑肌细胞(smooth muscle cells, SMCs)过度表达MMP-9可增加管壁周长，而非选择性MMPs抑制作用可减少动静脉瘘大鼠的外向性重构。同样，尸检获取人体冠状动脉标本也可观察到外向性重构斑块MMP-2和MMP-9含量超过内缩性重构斑块[5]。虽然，外向性重构在早期有益于维持管腔截面积和血流量，但血管镜及血管内超声检查的研究资料显示，不稳定性心绞痛患者冠脉病变多为外向性重构的较大病损[6]。提示斑块不稳定的标志，即粥样瘤纤维帽及肩区大量炎性细胞的浸润及胶原、SMCs含量减少与外向性重构相关。可见，基质降解增加可能削弱管壁的机械抵抗力，加重斑块不稳定，诱发不良心血管事件。许多细胞因子对MMPs表达有影响，其中AngⅡ能调节MMPs活性[7]。

本研究结果显示，AngⅡ组MMP-9表达明显高于对照组(P

目前，AngⅡ调控MMP-9表达的机制尚未明确。AngⅡ是RAS的活性中心和效应分子，可从两个方面(即作为血管活性物质引起血流动力学异常和作为生长促进因子诱导多种生长因子的产生)参与AS过程。大量研究表明，AngⅡ是转化生长因子-β(TGF-β)产生的强诱导剂。TGF-β在ECM积聚中起关键作用，其机制包括：① TGF-β能在转录水平上直接刺激多种ECM成分合成；② 通过抑制MMPs表达，促进纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor, PAI）和金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteases, TIMP)合成，从而减少ECM降解；③TGF-β还可通过刺激ECM受体-整合素(integrins)表达而促进ECM黏附与沉积[8]。基因分析表明[9]，MMPs基因的启动子上含有许多反应元件，如TATA盒、四佛波醇乙酸酯(TPA)应答元素、多瘤病毒增强子A-3(PEA-3)、AP-1结合点等调节MMPs基因转录。许多细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血小板生长因子(PDGF)等都可从转录水平上诱导MMPs合成，而转化生长因子-β(TGF-β)、干扰素-γ(INF-γ)则相反。AS形成过程中，IL-1、TNF-α上调MMPs表达，儿茶酚胺、AngⅡ及内皮素(endothelin, ET)能诱导心肌蛋白激酶-C水平升高。氯沙坦可特异性阻断AngⅡ与AT1受体的结合，降低TGF-β、PAI等细胞因子表达水平，从而下调MMP-9表达，降低其生物学效应。

综上所述，氯沙坦可阻断AngⅡ与AT1受体结合，下调AS斑块MMP-9表达，从而降低其生物学效应。但是，其分子机制还有待于进一步研究。

[参考文献]

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（收稿日期：2008-04-16）