pGEX―4T―1―Neurexin 1β原核表达载体构建及表达条件的优化
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇pGEX―4T―1―Neurexin 1β原核表达载体构建及表达条件的优化范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
【摘 要】目的：构建Neurexin 1β（Nrx 1β）原核表达重组体。方法：以pcDNA3.1-Myc-Nrx 1β真核表达载体为模板，经PCR扩增Nrx 1β目的基因，然后将其亚克隆入pgex-4t-1载体，构建其原核表达载体，转化入宿主菌BL21，选用IPTG进行诱导表达，优化表达条件， SDS-PAGE检测Nrx 1β的蛋白表达。结果：Nrx 1β目的基因扩增成功，经克隆后成功连接至pGEX-4T-1，重组体酶切结果及测序结果与预期结果一致。转化入BL21后在IPTG的作用下成功表达，且在24°C时， IPTG浓度为0.2 mmol/L诱导12 h后Nrx 1β的蛋白表达量最高。结论：该研究成功构建了pGEX-4T-1-Nrx 1β原核表达载体，并优化了Nrx 1β的蛋白表达条件，为下一步研究该蛋白质的功能奠定基础。
【Abstract】Objective： To construct the prokaryotic expressing plasmid recombinant for Neurexin 1β （Nrx 1β）. Method： Nrx 1β cDNA was obtained by PCR from pcDNA3.1-Myc-Nrx 1β eukaryotic expression vector， and cloned into the pGEX-4T-1 vector. The positive prokaryotic expression vector was transformed into Escherichia coli BL21. The expression of Nrx 1β was induced by IPTG with optical condition and was detected by SDS-PAGE. Result： Gene of Nrx 1β was successfully amplified， and the PCR product was ligated into pGEX-4T-1. Results of restriction enzyme digestion and sequencing were consistent with expectations. After transforming into BL21， the protein expression was successfully induced by IPTG. Conclusion： The study constructed Nrx 1β prokaryotic expressing plasmid recombinant successfully， and optimized the protein expression of Nrx 1β， which provide the foundation for studying the role of Nrx 1β in nervous system.
【Key words】Neurexin 1β； prokaryotic expressing vector； expression condition
1 引言
Neurexin（Nrx）是一种突触前膜蛋白，他们大多定位于突触前膜并含有一个跨膜结构域。其胞外结构域主要在突触间隙与其他蛋白质结合发挥作用，使神经元之间相互联系并形成突触[1]。在哺乳动物中，Nrx是由三个不同的基因（nrx1， 2， 3）分别由两个不同的启动子（上游α和下游β）转录为α-nrx 1-3及β-nrx 1-3，并最终翻译为Nrx 1α-3α及Nrx 1β-3β[2]。
Nrx最初是作为α-latrotoxin受体而被发现，α-latrotoxin与突触前受体Nrx结合并诱导大量神经递质的释放[3]。目前已报导的能与Nrxs发生相互作用的蛋白有neuroligins， leucine-rich repeat peoteins （LRRTMs）， latrophilin， neurexophilins， synaptotagmins， Cbln1-GluD2复合物等[4-9]。随着人们对Nrx的深入研究，发现Nrx与其受体相互作用后，参与细胞识别和细胞黏附，介导细胞信号转导，在突触形成及突触传递中发挥了重要作用，且通过突触的特异性影响神经网络的性能[4， 10， 11]。尽管如此，Nrx在突触发生形成和突触传递中的作用机制仍未完全阐明。因而对于Nrxs的功能和作用机制需要进行深入细致的研究。
pGEX-4T-1是目前在生命科学领域中研究较广泛的原核表达载体。本研究通过分子生物学手段成功构建了pGEX-4T-1-Nrx 1β原核表达载体，并获得Nrx 1β表达蛋白，为今后研究Nrx 1β的结构和功能提供参考。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1质粒及菌株
pcDNA3.1-Myc- Nrx 1β真核表达载体为作者本人构建保存，pGEX-4T-1载体及大肠杆菌JM109为作者实验室保存，BL21菌株购自北京全式金生物技术有限公司。
2.1.2试剂
CloneAmpHiFi PCR Premix及In-Fusion HD Cloning Kits购自Clontech公司；质粒小提试剂盒及琼脂糖均购自Promega公司；限制性内切酶BamHI、SamI及1 kb DNA Ladder购自New England Biolabs公司；LB培养基购自Invitrogen公司；胶回收纯化试剂盒购自吉凯公司；氨苄青霉素购自Sigma公司。
2.2 方法
2.2.1引物设计及目的基因扩增
根据GenBank中大鼠源Nrx 1β编码序列，设计上下游引物，上游引入BamHI酶切位点（加粗），下游引入SamI酶切位点（加粗）。上游引物为：5’-GGTTCCGCGTGGATCCATGTACCAGAGGATGCTCCGGTG-3’，下游引物为：5’-CGCTCGAGTCGACCCGGGTCAGACATAATACTCCTTATC-3’，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以pcDNA3.1-Myc-Nrx 1β为模板，利用合成的上下游引物进行PCR，扩增Nrx 1β目的基因，然后经琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.2.2构建Nrx 1β原核表达载体
将原核表达载体pGEX-4T-1用BamHI和SamI进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收pGEX-4T-1和目的基因片段。采用In-Fusion克隆反应体系进行连接，50C反应15 min。将连接产物转化JM109，后涂布于抗氨苄青霉素的LB琼脂平板。挑取阳性克隆进行小量扩增，提取质粒酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切条带。将电泳鉴定正确的阳性重组子，委托上海生工生物工程股份有限公司测序。将鉴定正确的重组质粒pGEX-4T-1-Nrx 1β重新转化入大肠杆菌BL21后，转化产物涂布于LB平板（Amp+），挑取单菌落，于LB培养基（含Amp）中培养后，保存菌种。
2.2.3目的基因诱导表达及SDS-PAGE检测
于5 ml LB培养基（含Amp）中加入少量已鉴定正确的阳性菌，37C摇床中培养至OD600为0.6-0.8，加入不同浓度（0.2 mmol/L， 0.5 mmol/L， 1 mmol/L， 2 mmol/L）IPTG，并在24C摇床中诱导培养不同时间（3 h，4 h， 5 h， 6 h， 8 h， 10 h， 12 h）。取1 ml菌液，离心，弃上清，加50 l上样缓冲液，沸水浴中10 min，离心，取5 l上样。考马斯亮蓝染色，脱色至条带明显。
3 结果与分析
3.1 Nrx 1β目的基因的扩增
利用设计合成的上下游引物，以pcDNA3.1-Myc- Nrx 1β重组质粒为模板进行PCR。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，发现一分子量约为1400 bp的DNA条带，与目的基因碱基数（1407 bp）大小一致（图1）。表明：成功扩增Nrx 1β目的基因。
图1 PCR扩增Nrx 1β基因
Fig. 1 Amolification of Nrx 1β gene by PCR
3.2 原核表达载体的构建与鉴定
将pGEX-4T-1经BamHI和SamI双酶切，使之线性化，并将上述扩增的目的基因克隆入pGEX-4T-1载体，筛选的阳性重组子经限制性内切酶BamHI、SamI进行双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳显示两条DN段（图2），一条与pGEX-4T-1载体碱基数相符，约为5000 bp， 另一条DN段（约1400 bp）与Nrx 1β碱基数一致，与预期结果一致。并且重组质粒经测序分析，测序结果与目的基因一致。结果表明：Nrx 1β原核表达载体成功构建。
图2 Nrx 1β重组质粒双酶切鉴定
Fig. 2 Identification of the recombinant Nrx 1β by restriction enzyme digestion
3.3 Nrx 1β基因的诱导表达
Nrx 1β重组阳性菌经过IPTG诱导后，SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。IPTG使用浓度为1 mmol/L，24 °C时诱导不同时间（3 h， 4 h， 5 h， 6 h， 8 h， 10 h， 12 h），结果显示Nrx 1β表达成功，表达蛋白大小约为80 kD，与预计值大小相符，且表达量与诱导时间呈正相关，以诱导12 h时Nrx 1β的表达最高（图3A）。但是选取不同浓度的IPTG（0.2mmol/L， 0.5 mmol/L， 1 mmol/L， 2 mmol/L）24 °C诱导12 h，Nrx 1β蛋白表达量无明显变化（图3B）。结果表明：在24°C时， IPTG浓度为0.2 mmol/L诱导12 h后Nrx 1β的蛋白表达量最高。
图3 SDS-PAGE检测Nrx 1β的表达，优化Nrx 1β的表达条件
Fig. 3 Detection and optimization of the expression of Nrx 1β by SDS-PAGE
4 讨论
突触形成开始于发育早期，并持续很长时间。神经元在突触地方彼此互相联系，从而形成一个巨大而又复杂的大脑信息处理网络。当一个神经元的轴突与另一个神经元的胞体或树突棘形成早期的突触连接时，两个平行而相互对应的细胞膜间有一定的间隙，形成突触。突触的形成主要是突触前成分和突触后成分相互作用的结果，有些蛋白质分子起着相当重要的作用，如神经细胞粘附分子等[12]。Nrx家族即属于神经细胞表面粘附分子，特异地表达于哺乳动物神经元，主要富集于突触前膜，是一类在神经突触形成过程中起关键作用的分子。因此，Nrx的功能值得进一步探讨。
pGEX-4T-1原核表达载体是一种能在宿主菌中诱导并高效表达的载体。pGEX-4T-1含有tac启动子，tac是trp启动子和lac启动子的杂合启动子，该启动子活性受lacI阻遏蛋白的调控，从而抑制载体上tac启动子的活性，抑制下游基因的转录，而在乳糖类似物IPTG诱导后，lac阻遏蛋白与其位点解离，可以使目的基因在启动子tac的作用下高效表达。
本文利用基因工程技术构建pGEX-4T-1-Nrx 1β原核表达载体。实验中，我们通过PCR技术扩增目的基因Nrx 1β，将目的基因与pGEX-4T-1载体连接，并将重组载体转化大肠杆菌后进行克隆筛选、测序鉴定等方法证实了该重组载体的构建成功。经IPTG诱导后获得稳定表达可溶性外源Nrx 1β融合蛋白的菌株，并优化了蛋白表达条件，为进一步研究Nrx 1β的结构及其在细胞中的作用奠定基础。
参考文献：
[1] Reissner C， Runkel F， Missler M. Neurexins [J]. Genome Biol， 2013，14（9）：213.
[2]Baudouin S， Scheiffele P. SnapShot： Neuroligin-neurexin complexes [J]. Cell， 2010， 141（5）：908.
[3]Ushkaryov YA， Petrenko AG， Geppert M， et al. Neurexins： synaptic cell surface proteins related to the alpha-latrotoxin receptor and laminin [J]. Science， 1992，257（5066）：50-56.
[4]Uemura T， Lee SJ， Yasumura M， et al. Trans-synaptic interaction of GluRdelta2 and Neurexin through Cbln1 mediates synapse formation in the cerebellum [J]. Cell， 2010，141（6）：1068-1079.
[5]Koehnke J， Katsamba PS， Ahlsen G， et al. Splice form dependence of beta-neurexin/neuroligin binding interactions [J]. Neuron， 2010，67（1）：61-74.
[6]Siddiqui TJ， Pancaroglu R， Kang Y， et al. LRRTMs and neuroligins bind neurexins with a differential code to cooperate in glutamate synapse development [J]. J Neurosci， 2010，30（22）： 495-506.
[7]Hata Y， Davletov B， Petrenko AG， et al. Interaction of synaptotagmin with the cytoplasmic domains of neurexins [J]. Neuron， 1993，10（2）：307-315.
[8]Boucard AA， Ko J， Südhof TC. High affinity neurexin binding to cell adhesion G-protein-coupled receptor CIRL1/latrophilin-1 produces an intercellular adhesion complex [J]. J BiolChem， 2012，287（12）：9399-9413.
[9]Perin MS. The COOH terminus of synaptotagmin mediates interaction with the neurexins [J]. J BiolChem， 1994，269（11）：8576-8581.
[10] Levinson JN， Chéry N， Huang K， et al. Neuroligins mediate excitatory and inhibitory synapse formation： involvement of PSD-95 and neurexin-1 in neuroligin induced xynaptic specificity [J]. J BiolChem， 2005，280 （17）：17312-17319.
[11] Fu Y， Huang ZJ. Differential dynamics and activity-dependent regulation of alpha- and beta-neurexins at developing GABAergic synapses [J].ProcNatlAcadSci U S A， 2010，107（52）： 22699-22704.
[12] Missaire M， Hindges R. The role of cell adhesion molecules in visual circuit formation： from neurite outgrowth to maps and synaptic specificity [J]. Dev Neurobiol， 2015，75（6）：569-583.
作者简介：徐岩（1979―），女，博士，助理研究员，研究方向：重大脑病分子机制及防治，在J Neuro Res、Neurosci Res发表多篇论文，获江苏省科学技术奖二等奖。*通讯作者：侯筱宇（1970-），女，博士，教授，博士生导师，研究方向：重大脑病分子机制及防治，在PNAS、Stroke、Biochem J、J Neurosci Res等发表多篇论文，获江苏省科学技术奖二等奖。