细胞凋亡与角膜移植免疫反应关系的初步研究
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作者：杨朝忠，张 军，华 山，吴艳蕊，祝东升，马路生
【摘要】 目的 研究细胞凋亡信号分子Fas和细胞凋亡因子FasL在新鲜及深低温保存后角膜的表达情况、角膜细胞凋亡情况及其与角膜移植免疫排斥反应的关系。方法 （1）对35例角膜移植手术（25例新鲜角膜、10例冷冻保存）剩余组织应用免疫组织化学SABC法分别进行Fas和FasL蛋白染色。（2）应用Tunel法对上述标本进行细胞凋亡的研究。（3）观察35例部分穿透性角膜移植免疫排斥反应发生发展情况。结果 （1）角膜细胞Fas蛋白及FasL蛋白均为细胞质和（或）细胞膜着色。角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞Fas蛋白均呈阳性表达。角膜上皮细胞及内皮细胞FasL蛋白均呈阳性表达，而角膜基质细胞则无FasL蛋白表达。新鲜角膜和冷冻保存后角膜的Fas、FasL蛋白阳性表达量经统计学分析差异无显著性。（2）凋亡的角膜细胞均为细胞核着色。25例新鲜角膜平均每高倍视野可见凋亡细胞（1.788±0.621）个，经冷冻保存后的角膜（10例）每高倍视野可见凋亡细胞平均为（8.164±2.126）个，经统计学处理P＜0.05，差异有显著性。（3）角膜移植免疫排斥反应发生与角膜的新鲜程度有关，新鲜角膜部分穿透性角膜移植术后6～12个月的免疫排斥反应发生率为12%（3/25），深低温保存角膜移植后6～12个月的免疫排斥反应发生率为10%（1/10），二者差异无显著性（P＞0.05）。结论 （1）新鲜和深低温保存后的角膜均可见Fas、FasL蛋白的表达。其中Fas在角膜上皮、基质和内皮细胞均表达，FasL在角膜上皮、内皮细胞表达，而基质细胞不表达。（2）新鲜角膜可见极少量凋亡细胞，角膜经深低温冷冻保存后，凋亡细胞数量显著增加。降温-复温损伤可能与细胞凋亡有关。（3）角膜移植免疫排斥反应发生与角膜的新鲜程度有一定关系，深低温保存后角膜的抗原性可能降低，不易引起免疫排斥反应的发生。
【关键词】 Fas蛋白；FasL蛋白；凋亡；角膜移植免疫排斥
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between expression of Fas/FasL and apoptotic cells in normal cornea and deep cryopreservative with cornea graft rejection in human.Methods SABC immunohistochemistry method was applied to study the expression of Fas/FasL in paraffin-embeded sections of 35 cornea.The tunel(TdT mediated biotin dUTP nick-end labeling，TUNEL) technique was used to study whether apoptosis would happy in both normal cornea and deep cryopreservative in human.Results In all positive cells，Fas/FasL were kytoplasm and cell membrane was stained.The positive expression of Fas protein was detected in 35/55 cornea，so was Fasl protein.Fas protein is expressed in corneal epithelial，keratocyte and endothelial cells.FasL ligand protein was detected in corneal epithelial and endothelial，neither was keratocyte cells.The number of apoptotic cells was significantly higher after cryopreservation(8.164±2.126) than noncryopreservation (1.788±0.621) (P＜0.05).The rate of cornea graft rejection was 12%(nomal cornea) and 10%(cryopreservative cornea).Conclusion Fas protein and FasL ligand protein expressed in all cornea were not related to cryopreservation.The freeze-thaw trauma was maybe related to cryopreservation-induced cell apoptosis.It may reduce the rate of cornea graft rejection.
【Key words】 Fas protein；FasL protein；apoptosis；cornea graft rejection
角膜病是常见的致盲眼病，居致盲眼病的第二位。角膜移植手术是治疗角膜盲的重要手段。角膜材料的质量是影响角膜移植手术成功与否的主要因素。在保存过程中角膜细胞特别是角膜内皮细胞常受损，其可能的机制为死亡和细胞凋亡。Fas/FasL是与细胞凋亡密切相关的一对基因。FasL在角膜的广泛分布对维持角膜的免疫赦免地位和角膜移植的高成功率有重大意义。目前，角膜Fas/FasL及细胞凋亡与角膜移植免疫排斥反应关系的研究尚少。本文就细胞凋亡与角膜移植免疫排斥反应关系的初步研究结果报告如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象 35例(35眼)角膜移植患者系2000～2002年随即就诊，为单纯性角膜白斑，植片为7～7.75mm部分穿透性角膜移植，男23例(23眼)，女12例(12眼)；角膜为本院眼库提供，25例新鲜角膜，10例为深低温冷冻保存角膜。手术时将剩余角膜用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm切片。冷冻保存法采用简易二步法深低温保存［1］，冷冻时间1周～10个月，平均冷冻时间为（5.12±3.47）个月。
1.2 试剂及主要器械 Fas、FasL蛋白染色及Tunel法细胞凋亡试剂（武汉博士德公司分装的即用型试剂盒）；深低温保存角膜试剂有二甲基亚枫（DMSO），20%人血白蛋白，液氮，QL-Ⅱ型生物降温仪。
1.3 实验方法
1.3.1 Fas、FasL蛋白免疫组织化学检测方法 采用即用型SABC法。阳性对照组：Fas、FasL试剂盒中自带阳性对照片作为阳性对照组；阴性对照组：用PBS代替一抗作为阴性对照组。
1.3.2 细胞凋亡检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的DNA缺口生物素-dUTP标记法［2］（TdT mediated biotin dUTP nick-end labeling，TUNEL）原位标记。
1.4 实验结果判断
1.4.1 Fas、FasL判断 以细胞膜和（或）细胞质有清晰棕黄色颗粒着色为阳性染色细胞，细胞膜或细胞质无清晰棕黄色颗粒或无着色为阴性。
1.4.2 凋亡细胞判断 以细胞核呈棕黄色着色为阳性染色细胞，胞核无棕黄色着色为阴性细胞。每张切片随机取6个视野（高倍镜下）记数，取平均值为该片凋亡细胞数。
1.5 统计学方法 根据资料性质，分别采用完全随机设计资料的方差分析和t检验。P＜0.05为差异有显著性。本实验所有统计均用SPSS统计软件包进行统计分析。
2 结果
2.1 角膜细胞Fas蛋白及FasL蛋白全为细胞质和（或）细胞膜着色 35例角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞Fas蛋白均呈阳性表达。角膜上皮细胞及内皮细胞FasL蛋白均呈阳性表达，而角膜基质细胞则无FasL蛋白表达。新鲜角膜和冷冻保存后角膜的Fas、FasL蛋白阳性表达量经统计学分析差异无显著性。
2.2 细胞凋亡检测结果
2.2.1 凋亡细胞特征 发生凋亡的细胞皱缩，核的改变最明显，典型的染色质断裂、分离、浓缩形成密集颗粒，聚集于核被膜下呈新月形或帽状。继续发展可出现凋亡小体，其特点是具备完整的膜状结构，胞膜表面微绒毛消失，内容物除了胞质以外，主要含有降解的染色质片段。本实验采用Tunel方法检测，DAB作为显色底物，显微镜下观察，细胞核含有棕黄色颗粒的细胞即为阳性细胞。
2.2.2 深低温保存与角膜细胞凋亡的关系 本实验结果发现，所有阴性对照组均未见Tunel阳性细胞；阳性对照组可见大量Tunel阳性细胞。新鲜角膜仅在上皮层偶发现少许凋亡细胞，经冷冻保存后，凋亡细胞显著增加，上皮、基质和内皮细胞层均可见到凋亡细胞。见表1。
表1 新鲜角膜及冷冻保存后凋亡细胞情况 (x±s)
由表1可见，深低温冷冻保存后角膜的凋亡细胞数量明显较新鲜角膜增加，二者差异有显著性（P＜0.05），冷冻-复温损伤与细胞凋亡可能有关。
2.3 角膜移植免疫排斥反应发生与角膜的新鲜程度有关 新鲜角膜部分穿透性角膜移植术后6～12个月的免疫排斥反应发生率为12%（3/25），深低温保存角膜移植后6～12个月的免疫排斥反应发生率为10%（1/10），二者差异无显著性（P＞0.05）。
3 讨论
角膜的高度透明性是实现视觉器官正常生理功能的重要条件之一，而解剖形态完整和生理功能正常的角膜内皮层对于保持角膜的半脱水状态、正常厚度及透明性起着关键性作用。当各种原因致角膜内皮细胞降至其生理界限值以下时，就会产生功能失代偿，导致角膜水肿进而混浊。据报道角膜盲占全球盲目的1/3［3］，穿透性角膜移植手术是其复明的主要治疗方法。眼库的设立使这些患者行角膜移植手术的可能性大大增加，但是供体角膜来源的短缺及术后免疫排斥反应的发生直接影响着角膜移植手术的开展和成败［4］。故提高眼库保存技术和保存质量尤为重要。目前，眼库常用的角膜保存方法有短期（湿房）、中期及长期（深低温）保存法［5］。其中深低温保存法保存角膜时间最长，可为无眼库地区提供角膜。但一些因素，如供体角膜离体时间、降温和复温的速率、保存液的组分等均可影响角膜保存质量、导致角膜细胞尤其角膜内皮细胞损失，其可能的机制一为死亡，二为细胞凋亡。
凋亡是一种基因介导的生理过程［6］，在多细胞生物体的胚胎发育分化、组织塑型、组织自稳的维持和调节、组织受损后细胞再生及肿瘤回退过程中都起着重要的作用［7，8］。分子生物学研究发现有大量的基因与细胞死亡和抗细胞死亡有关。在这些基因中有Ced-3(IL-1β转换酶样半胱氨酸蛋白酶）、p53（一种肿瘤抑制因子)、bc1-2（一种细胞凋亡抑制基因）、bax(bc1-2家庭成员之一)。Fas和FasL也在其中，二者构成了一条独特的细胞凋亡通路，参与了多种疾病的病理生理过程，具有潜在的临床应用价值，已成为凋亡研究领域的新热点。
Fas是新近发现的细胞凋亡的信号分子［9，10］，Fas基因定位于人染色体10q 24.1，全长2543bp，含9个外显子和8个内含子。人的Fas基因编码产物由325个氨基酸组成，分子量为45000，属Ⅰ型膜蛋白，是细胞膜表面的受体蛋白。Fas蛋白的N端在膜外，C端在膜内，C端有约60～70个氨基酸组成，C末端15个氨基酸若被除去，则细胞对凋亡的敏感性增强，因此被认为是抑制凋亡功能区［10］。在人的外周血中有3种可溶性Fas分子（sFas），sFas与Fas配体有很强的亲和力，起间接抑制凋亡作用，可能为体内细胞凋亡的一种调节方式［11］。
FasL是新近发现的细胞凋亡因子，FasL基因定位于人染色体1q23［12，13］，包含8000bp，属Ⅱ型糖蛋白。FasL分子以膜结合蛋白p40和可溶性蛋白p27形式存在，通常p40以单体形式存在，当与Fas分子结合时形成二聚体，从而激活胞内Fas死亡信号序列的活性。
3.1 Fas/FasL的表达情况 目前研究发现Fas为非特异性抗原分子［14］，在角膜、虹膜、视网膜等免疫赦免部位有持续的FasL表达。本研究表明，成人角膜Fas、FasL的表达率为100%（35/35）。深低温保存角膜Fas/FasL蛋白表达与新鲜标本差异无显著性（P＞0.05）。笔者认为可能的原因为：（1）Fas/FasL蛋白表达需要信号刺激、转录、翻译及蛋白质合成等复杂过程；而深低温保存却几乎立即将细胞内所有“代谢活动”处于“休眠”状态。（2）使角膜Fas/FasL蛋白表达改变的适宜刺激多为涉及免疫学改变的因素，如角膜移植、感染及肿瘤发生等情况，而在正常情况下Fas/FasL的表达维持一种自稳状态。深低温保存不是刺激Fas/FasL表达的适宜刺激。
3.2 Fas/FasL表达与免疫赦免 Fas/FasL在免疫赦免、免疫耐受及移植免疫中作用日益受到重视。晚近的研究表明，免疫赦免与角膜上皮、角膜内皮、虹膜、睫状体及视网膜持续表达功能性Fas/FasL关系甚密。Criffith将单纯疱疹病毒注入前房，正常小鼠仅引起轻微的炎症反应，并可查见发生凋亡的白细胞，而在g1d小鼠不仅缺乏凋亡细胞，而且发生严重的炎症反应，并扩展到眼后节。以上实验表明，FasL能够诱导进入眼中的白细胞发生凋亡，限制免疫反应和炎症的发生和扩散，从而维护这些器官的免疫赦免状态。本研究发现角膜上皮、基质和内皮细胞Fas均表达，FasL在角膜上皮和内皮细胞均表达。Wilson［15］采用逆转录聚合酶链反应研究发现，新鲜及冷冻的人角膜上皮、基质、内皮细胞均有Fas蛋白，而FasL蛋白仅发现于角膜上皮和内皮细胞，在角膜基质细胞没有发现，与本研究结果相同。
3.3 Fas/FasL介导细胞凋亡与角膜移植 Fas/FasL在眼部的表达除与免疫赦免关系密切外，Fas/FasL所介导的细胞凋亡在角膜创伤愈合、角膜移植后的低排斥率及角膜发育中均有重要的意义。Jianping Gao［16］采用兔模型行PRK，结果发现正常角膜存在极有限的凋亡，主要存在于角膜上皮层的表层，基底细胞层很少，基质和内皮细胞层则没有；而PRK后4天和4周，整个上皮层均存在凋亡，基质和内皮凋亡细胞也明显增多。Wilson［17，18］认为PRK术后受损的角膜上皮细胞释放一些细胞因子，如sFasL和IL-1等，它们作用于基质细胞令其凋亡。Kim［19］通过刮除8周龄兔角膜上皮来观察角膜形态的改变，发现慢性角膜损伤可导致角膜上皮明显增生，上皮下浅基质层细胞存在凋亡，16周后测量实验组角膜厚度平均为（277±15）μm，而对照组为（356±6）μm，故认为慢性角膜上皮损伤可诱导角膜基质变薄，与圆锥角膜形成关系密切。Yamagami-S等［20］为研究Fas/FasL相互作用在同种角膜移植中的作用，采用C57BL/6（B6，FasL+）和B6-g1d（FasL-）鼠作为角膜供者，BALB/C鼠作为受者行角膜移植，观察两组排斥率，结果8周后FasL-组的排斥率为89%，显著高于FasL+组，后者为47%。采用Tunel法发现FasL+组有凋亡的炎症细胞附着于角膜内皮面，而FasL-则没有。Stuart［21］进行了类似的研究，发现Fas+小鼠角膜植片45%成活率，而FasL-小鼠则100%排斥，在Fas+的角膜片中发现了凋亡的单核细胞，在Fas-的角膜植片中发现了大量的炎症细胞，但未发现凋亡细胞。以上均说明角膜所表达的FasL可以诱导Fas+的细胞凋亡，可见Fas/FasL所介导的细胞凋亡在角膜移植高成功率中发挥着重要作用。本研究未发现深低温保存后角膜与新鲜角膜标本Fas/FasL表达有差别，故尚不能肯定深低温保存后凋亡细胞的显著增加与Fas/FasL关系密切。但影响细胞凋亡的因素甚多，基因方面有BcL-2，p53等；影响Fas/FasL蛋白表达的因素亦很多，如基因的结构、转录和翻译等。故Fas/FasL与深低温保存角膜后凋亡细胞数量显著增加的关系尚需进一步研究。
3.4 深低温保存角膜与细胞凋亡 本研究结果显示，新鲜角膜的凋亡细胞较少，平均每个高倍视野仅可见（1.788±0.621）个，上皮细胞层明显，基质和内皮细胞层则基本未见。经冷冻保存后凋亡细胞数量明显增加，平均每高倍视野（8.164±2.126）个，上皮和内皮细胞层均可见到典型的凋亡细胞，经统计学处理二者差异有显著性（P＜0.05）。钟兴武［22］采用M-K、M-K+EGF（表皮生长因子）、Optisol 3种保存液行兔角膜中期保存、Tunel法观察凋亡细胞，结果用3种保存液分别保存3、5、7天后，在角膜上皮、基质及内皮细胞层均可见凋亡细胞，3、5、7天平均凋亡细胞数为：M-K液：4.67±0.82，19.67±2.50，36.33±4.03；M-K+EGF液：5.83±1.72，17.83±3.31，35.17±5.08；Optisol液：1.00±0.63，11.83±1.47，18.67±2.50。Borderie［23］的研究结果发现经冷冻保存后凋亡细胞数比非冷冻保存的凋亡细胞数显著增加，复温后2h凋亡细胞数＞5%；将冷冻保存后的角膜细胞再进行原代培养，发现用前一种方法的成活细胞比率比后一种方法高；而且发现不同浓度的白蛋白对结果无明显影响。本研究结果与Borderie结果类似，提示冷冻-复温损伤与细胞凋亡有关。
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