银杏叶片愈伤组织诱导的激素组合培养条件分析

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇银杏叶片愈伤组织诱导的激素组合培养条件分析范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘要：以银杏（Ginkgo biloba L.）叶片外植体为试材，研究了不同激素组合培养条件对银杏叶片外植体脱分化诱导愈伤组织的效果。结果表明，不同激素组合培养条件对银杏叶片外植体启动脱分化（膨大）的效应极显著，且膨大率与膨大速度之间具有良好的一致性；不同培养条件对银杏叶片外植体愈伤组织诱导形成的效应极显著，且愈伤组织的诱导率与诱导速度之间具有较好的协同性；综合各项测量指标，当培养基中激素组合为MS+2.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L NAA +0.3 mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT时，银杏叶片诱导愈伤组织诱导效果相对最佳。

关键词：银杏（Ginkgo biloba L.）；叶片；膨大；愈伤诱导；培养条件

中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）01-0216-04

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.01.057

银杏（Ginkgo biloba L.）为银杏科银杏属落叶乔木，又名白果、公孙树、鸭脚树、蒲扇，是新生代第四纪冰川期的孑遗植物，素有裸子植物“活化石”之称，为中国独存的珍稀名贵树种[1]。银杏叶中含有黄酮类化合物和萜内酯类化合物等多种生理活性物质，具有扩张血管、增加血流量、改善血液循环、降低脑血管阻力、抑制血栓形成、改善脑细胞代谢水平等作用[2-4]，已经在食品、保健、医药等领域得到广泛开发利用。目前，利用银杏愈伤组织的细胞悬浮培养生产黄酮类次生代谢产物成为近年来发展的新领域[5-7]，但是由于银杏初始愈伤组织的品质与特性差异，往往造成生产量偏低，很难满足工业化生产的需要。目前，许多研究者从不同侧面探索银杏离体培养中培养基类型、激素、培养条件及其他相关因素对银杏愈伤诱导的影响[8-11]。本研究以银杏叶片为试材，以2，4-D、NAA、6-BA与KT 4种激素为效应变量，分析不同激素组合培养条件对银杏叶片外植体启动脱分化与愈伤诱导的效应方式与效应大小，为进一步优化银杏愈伤组织培养条件，提高银杏愈伤组织诱导效率，促进其大规模细胞悬浮培养生产有效次生代谢产物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

取陕西理工学院校园内一株约10年生银杏树干萌发的幼嫩枝条上的新鲜叶片作为试验材料。试验用NAA（α-奈乙酸）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、2， 4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）与KT（呋喃氨基嘌呤）均为分析纯；培养基为MS培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 试验材料预处理 选择颜色鲜绿、完整健康、大小一致的银杏叶片，用纱布擦掉表面灰尘，然后用自来水冲洗表面的杂质1～2 h，在超净工作台采用乙醇-升汞配合消毒。将试材装入消毒好的广口瓶中，首先用75%乙醇表面消毒30 s，再用0.1%升汞（HgCl2）浸泡10 min，处理过程中不断摇动，保证消毒液与叶片充分接触，然后用无菌蒸馏水冲洗5～6次，每次2～3 min，放置于无菌滤纸上吸干水分。无菌操作条件下用解剖刀将银杏叶片切分为长宽约0.5 cm的小块，接种至不同组合的诱导培养基。

1.2.2 培养基配制 在MS培养基中加入不同剂量的NAA、6-BA、2，4-D与KT 4种激素，配制成试验所需的培养基（表1），各培养基中均按3.0%的浓度加入蔗糖，按0.6%的浓度加入琼脂粉，调整pH为5.8～6.0，在121 ℃、1.3～1.5大气压下灭菌20 min，备用。

1.2.3 材料处理与诱导 无菌操作条件下，将预先准备好的银杏叶片外植体，分别接种至Ⅰ～Ⅸ培养基中，放置于温度（25±2） ℃，相对湿度50%～60%，黑暗培养30 d，观察愈伤组织的形态、颜色、质地及生长情况，定期统计各处理中体积明显膨大的外植体数与诱导出愈的外植体数，并依此计算出相应的二级变量。

1.2.4 数据统计与分析 接种10 d后，去除污染与坏死材料，统计无菌外植体数，视为接种外植体总数。依据定期统计的膨大数、出愈数计算出膨大率、膨大速度、诱导率与诱导速度。计算公式如下：

膨大率=膨大外植体数/接种外植体总数×100%

膨大速度=（WN-WM）/[（N-M）×Y]

诱导率=诱导出愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%

诱导速度=（ZN-ZM）/[（N-M）×K]

式中，WN代表第N天膨大的外植体数，WM代表第M天膨大的外植体数，K代表接种外植体总数，ZN代表第N天出愈的外植体数，ZM代表第M天出愈的外植体数。

采用SPSS 19.0统计软件，对试验数据进行one-way ANOVA分析，研究不同培养条件对银杏叶片愈伤组织诱导的效应。

2 结果与分析

2.1 不同培养条件下银杏叶片愈伤诱导的基本情况

将银杏叶片外植体接种至试验设计的9种培养基中，第三天左右各处理外植体颜色明显加深，由原来的嫩绿色变为深绿色，第七天外植体明显膨大，边角增厚向内卷曲，体积增加，在切口处及外植体表面产生少量淡黄色颗粒状突起。第十天各处理培养基中外植体表面形成一薄层愈伤组织，最初为白色或淡黄色颗粒状，质地比较致密，随着培养时间的延长，愈伤细胞不断分裂生长，外植体整个表面都被愈伤组织所覆盖，愈伤颜色加深，多为黄绿色或绿色，质地疏松或致密。不同激素组合处理对银杏叶片愈伤组织诱导均有效果。激素组合配比方式不同，外植体的膨大频率与愈伤诱导频率存在明显差异，愈伤组织的颜色、质地及愈伤生长情况也不尽相同（表2）。

2.2 不同培养条件对银杏叶片外植体膨大的效应

以不同激素组合培养条件为自变量，分别以膨大率与膨大速度为因变量作单因素方差分析，统计分析结果见表3。单因素方差分析结果表明，不同激素组合条件对银杏叶片外植体启动脱分化的效应极显著（F=48.465，P

2.3 不同培养条件对银杏叶片外植体出愈的效应

诱导率作为衡量外植体出愈效果的一项重要指标，它能够从量化角度评价愈伤组织发生的最佳条件，诱导速度则从动态变化的角度来衡量外植体愈伤发生与积累的快慢程度。以不同激素组合培养条件为自变量，以愈伤诱导率与诱导速度为因变量进行单因素方差分析，结果如表4所示。

由单因素方差分析可知，不同激素组合培养条件对银杏叶片外植体诱导率与诱导速度的效应均为极显著（F=71.509，P

3 小结与讨论

研究报道愈伤组织的形成和生长是受多种因素的影响，其中激素对植物离体培养中的细胞分化和形态建成具有明显的调节作用[12]。植物激素对植物离体培养具有非常重要的调控作用，是愈伤组织诱导的主导因素，选择合适的激素种类和浓度是愈伤组织诱导和生长的关键因素[13]。植物组织培养过程中，激素种类、浓度及其配比对于协调细胞生长、分化和代谢起重要作用。本研究以2，4-D、NAA、6-BA与KT 4种激素相互配比组合，形成多元化激素组合诱导培养条件，分析不同培养条件对银杏叶片外植体脱分化诱导愈伤组织的效应大小与效应方式。结果表明，不同激素组合培养条件对银杏叶片外植体离体培养中膨大率、膨大速度、愈伤诱导率与诱导速度4个因变量的效应均为极显著，这种激素组合配比对外植体启动脱分化（膨大）与愈伤诱导效果的差异性分化，为银杏叶片外植体愈伤组织诱导中最佳激素组配方式的筛选提供了前提。

综合分析各效应指标，对于膨大率而言，Ⅳ处理和Ⅷ号表现出较优的诱导效果，而对于膨大速度而言Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ处理之间基本持平，外植体启动脱分化速度相对较快；对于诱导率效应指标，Ⅳ处理所有外植体全部出愈，愈伤诱导率最高；且Ⅰ与Ⅳ处理在诱导速度变量上表现出相对优势，诱导速度较快，其余各组相对较慢。对比各处理诱导效果可知，对于处理Ⅶ而言，在试验测量的4个效应指标上均处于低水平状态，可见此处理并不利于银杏叶片外植体愈伤组织的诱导。综合分析各激素组合处理的愈伤诱导率与速度，结合愈伤组织的品质与生长积累量状态，可以看出处理Ⅳ在各因变量指标上均表现出高效应，是银杏叶片愈伤诱导的理想条件，即当培养中激素组合培养条件为MS+2.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L NAA +0.3 mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT时，银杏叶片外植体脱分化诱导愈伤组织效果相对最佳。

参考文献：

[1] 王莲辉，邓龙玲，杨方成，等.银杏快速繁殖及脱毒技术研究[J]. 中国野生植物资源，2003，22（2）：73-75.

[2] 王德伟，朱 红，高 尔.银杏黄酮的药理作用和临床应用[J]. 食品和药品，2006，8（6）：7-9.

[3] 张传丽，陈 鹏.银杏类黄酮研究进展[J].北方园艺，2014（3）：177-181.

[4] 陈西娟，王成章，叶建中.银杏叶化学成分及其应用研究进展[J]. 生物质化学工程，2008，42（4）：57-62.

[5] 秦卫东，高明侠，吕兆启.银杏愈伤组织培养及其黄酮生物合成的初步探讨[J].食品科学，2002，23（11）：38-41.

[6] 胡燕梅，唐兴国，宋鹏飞，等.银杏叶愈伤组织培养及黄酮积累的正交实验优化[J].化学与生物工程，2009，26（9）：59-62.

[7] 邵菊芳，朱红威，马 毅，等.银杏愈伤组织细胞中总黄酮提取工艺的比较[J].中国农学通报，2011（30）：237-240.

[8] 陈 雷，刘新亮，王欢利，等.微量元素对银杏愈伤组织诱导及生长的影响[J].东北林业大学学报，2013（5）：7-10.

[9] 杜希华，孙秀玲，郝岗平，等.不同外植体和激素对银杏愈伤组织诱导和生长的影响[J].山东师范大学学报（自然科学版），2008（1）：129-133.

[10] 张德华，张占甲，陈坤明，等.银杏组织培养研究Ⅰ.不同培养条件对银杏愈伤组织形成的影响[J].西北植物学报，1994，14（6）：29-32.

[11] 崔 刚，唐 蕾，王 武.培养基和外源激素对银杏愈伤组织诱导、生长及叶绿素含量的影响[J].食品与生物技术学报，2008（2）：117-122.

[12] 吕冬霞，曲长福.植物生长调节剂对愈伤组织培养的影响[J].北方园艺，2004（5）：68.

[13] 熊国胜，李家洋，王永红.植物激素调控研究进展[J].科学通报，2009，54（18）：2718-2733.