野天然活性成分蒙花苷的提取

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摘要：选用基质固相萃取技术，采用正交优化设计试验，研究野中天然活性成分蒙花苷提取的最佳工艺。在四氟芯层析柱中加入硅胶氧化铝野花序粉，用正己烷－乙酸乙酯－丙酮的溶液组合进行极性洗脱，并采用高效液相色谱法测定蒙花苷的含量。结果表明，野花序中蒙花苷的最佳工艺条件为萃取时间１．５ ｈ，萃取温度为３０℃，洗脱剂体积比为１∶2∶3。

关键词：野花序；蒙花苷；正交试验；高效液相色谱法

中图分类号：Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）08－1663-03

Extracting Linarin, a Natural Active Ingredient from Wild Chrysanthemum

ＣＨＡＩ Ｈｏｎｇ－ｌｉｎｇ，ＷＵ Ｌｉｎ－ｓｅｎ，ＪＩＮ Xｉａｏ－ｃｈｕｎ

（Ｂｒａｎｃｈ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｌｉｓｈｕｉ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｉｓｈｕｉ ３２３０００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｌｉｎａｒｉｎ ｆｒｏｍ ｗｉｌｄ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｂｙ ｍａｔｒｉｘ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ａｄｄｉｎｇ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ－Ａｌｕｍｉｎａ－Ｐｏｌｌｅｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＰＴＦＥ ｃｏｒｅ ｆｉｒｓｔｌｙ， ｔｈｅｎ ｐｏｌａｒｉｔｙ ｅｌｕｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｘａｎｅ－ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ－ａｃｅｔｏｎｅ， ａｎｄ ｆｉｎａｌｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｌｉｎａｒｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｌｉｎａｒｉｎ ｆｒｏｍ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ １．５ ｈ ａｔ ３０℃ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｌｕｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ １∶2∶3．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓ ｏｆ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ； ｌｉｎａｒｉｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ； ＨＰＬＣ

野（Flos Chrysanthemi Indici）具有抗病原微生物、治疗心血管系统疾病、降压、降低血小板聚集的影响、抗炎、免疫、抗氧化等作用［１］。此外还用于治疗肿瘤、高血压和高血脂等症，对感冒、流行性脑膜炎也有一定预防作用［２，３］。

蒙花苷是众多黄酮类化合物中活性较高的化合物之一，由刺槐素和一个苷元组成，化学结构式见图１。蒙花苷又称刺槐苷、金合欢因、野黄酮苷、刺槐素－７－Ｏ－β－Ｄ－芸香糖苷等，以两种异构体形式的化合物α体和β体。蒙花苷及其衍生物在植物界分布广泛，存在于许多植物的花、叶、果实中，多以苷的形式存在。其中以野花序中含量最多，是野中重要的药效成分［６，７］。近年来国内外研究表明，蒙花苷具有非常广泛的生理和药理活性，对预防糖尿病和改善糖尿病有显著的作用，还具有抑制磷酸二酯酶、醛糖还原酶、金黄色葡萄球菌、乙型溶血链球菌、抗菌等作用［４，５］，能保护肝脏，并对慢性气管炎有一定疗效［８］。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１野试验用野干燥花序购于浙江中医院中药房。将其放入研钵中研磨成粉状，装入烧杯并用保鲜膜封好，备用。

１．１．２试剂蒙花苷、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、冰醋酸、氧化铝、硅胶等。

１．１．３仪器ＹＰ２０２Ｎ电子天平，上海精密科学仪器有限公司；四氟芯层析柱，上海立亚太玻璃仪器制造有限公司杭州分公司；Ｗａｔｅｒｓ ＡｃＱｕｉｔｙ高效液相色谱仪，美国Ｗａｔｅｒｓ公司；ＵＶ ２５０１ ＰＣ紫外－可见分光光度计，日本导津；烧杯，研钵，漏斗，玻璃棒，移液管，容量瓶，干燥器等。

１．２方法

１．２．１蒙花苷的提取精密称取１．２ ｇ野花序粉、２．４ ｇ硅胶和 ２．４ ｇ氧化铝，加入２０ ｍＬ去离子水，搅拌均匀后装入已固定在铁架台上的四氟芯层析柱中。每间隔１５ ｍｉｎ分别加入正己烷、乙酸乙酯、丙酮进行从小到大的极性洗脱。将洗脱液进行抽滤得到黄色滤液，用滤纸再次过滤，得到澄清的黄色滤液即为蒙花苷提取液，放置阴暗处备用。

１．２．２单因素试验精密称取１．２ ｇ野花序粉，在不同的萃取时间、萃取温度、洗脱剂体积比（Ｖ正己烷∶Ｖ乙酸乙酯∶Ｖ丙酮）下进行单因素试验。结束后将洗脱液进行抽滤得到黄色滤液。将黄色滤液用滤纸再次过滤，得到蒙花苷提取液，去离子水定容至５０ ｍＬ。测定蒙花苷在３２６ ｎｍ的吸光度，并计算出相应的蒙花苷的含量。

１．２．３正交优化试验准确称取１．２ ｇ野花序干粉末以不同的萃取时间、萃取温度、洗脱剂体积比为考察因素，根据单因素试验的结果，再选用

Ｌ９（３３）正交表进行正交试验，因素与水平设计见表1，测定蒙花苷含量。

１．２．４高效液相色谱仪的检测［９］色谱柱：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ－Ｃ１８柱（３．９ ｍｍ×１５０．０ ｍｍ，５ μｍ），流动相∶甲醇－水－冰醋酸（５２∶４６∶２）；流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长：３２６ ｎｍ；柱温：３０℃，进样方式：手动进样；进样量：５ μＬ。

取蒙花苷标准品１．２ ｍｇ溶于甲醇，于５０ ｍＬ容量瓶中定容，得蒙花苷标准品液。从中取２ ｍＬ移至液相用小烧杯中，为标１。再从中分别取２ ｍＬ于４只试管中，分别稀释成２、３、４、５倍，并移至小烧杯中，为标２、３、４、５。取定容的提取液各２ ｍＬ于５０ ｍＬ容量瓶中，用３０％乙醇稀释至刻度，１５ ｍｉｎ后以空白标准液作对照，于３２６ ｎｍ处测定吸光度，计算提取液的蒙花苷含量。

２结果与分析

２．１高效液相色谱仪的检测

２．１．１检测波长的选择取蒙花苷标准品，用甲醇配成溶液进行２００～４００ ｎｍ的光谱扫描。光谱图显示，其在２０７、２６７、３２６ ｎｍ附近均有较大吸收峰。在３２６ ｎｍ峰面积最大，为减少其他成分对蒙花苷测定的干扰，特选择３２６ ｎｍ作为检测波长。

２．１．２线性关系的考察将标１、标２、标３分别取样５ μＬ，按1．２．4所述条件进行测定，结果表明，蒙花苷在进样量为０．０４８～２．１３0 μＬ的范围内与峰面积具有良好的线性关系。以峰面积（ｙ）为纵坐标，蒙花苷浓度（ｘ）为横坐标，绘制标准曲线，得曲线的回归方程＝１ ９８０ｘ－７．５６0，ｒ＝０．９９９ ９。

２．１．３精密度试验精密吸取对照品溶液５ μＬ连续进样６次，蒙花苷峰面积ＣＶ为０．７８％。

２．１．４重复性测定取样品粉末约２．４ ｍｇ，按上述供试品溶液的制备方法和测定条件，制备６份供试液，蒙花苷含量测定结果的ＣＶ为１．３０％。

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２．１．５稳定性试验分别制备对照品溶液和供试品溶液，室温下放置，分别于０、２、４、６、８、１２ ｈ进样测定，记录蒙花苷色谱峰峰面积，计算变异系数，结果表明，对照品溶液中蒙花苷色谱峰峰面积ＣＶ为０．４８％，供试品溶液中蒙花苷色谱峰峰面积ＣＶ为０．８１％，表明对照品和供试品溶液在１２ ｈ内稳定。

２．１．６回收率试验采用加样回收试验，取已知含量的野粉末０．１２ ｇ，共６份，精密称定，按对照品加入量与所取供试品含量之比为１∶１的比例加入蒙花苷对照品，制备供试品溶液，分别测定，计算回收率。结果表明，蒙花苷的平均回收率为９７．４％，ＣＶ为２．４２％。

２．１．７色谱分析通过对图２和图３的比较，以及对照品的光谱，可以看出保留时间约在１．８９ ｍｉｎ左右，可以断定这就是蒙花苷，即第３个吸收峰为蒙花苷的吸收峰。

２．２单因素试验

２．２．１萃取时间对蒙花苷提取量的影响在常温下，在不同的萃取时间下提取蒙花苷，测定提取液中蒙花苷含量，结果见图４。由图４可知，野中蒙花苷提取量随萃取时间的延长而增大，但萃取１．５ ｈ后，蒙花苷的含量开始降低，故萃取时间为１．５ ｈ时提取效果最好。

２．２．２萃取温度对蒙花苷提取量的影响在不同温度下，用洗脱试剂体积比１∶１∶１的洗脱试剂提取１．５ ｈ后，测定提取液中蒙花苷含量，结果见图５。由图５可知，野中蒙花苷含量在提取温度为２５ ℃时最高，故提取温度以２５ ℃为宜。

２．２．３洗脱剂体积比对蒙花苷提取量的影响以不同洗脱剂体积比，在２５ ℃下，提取１．５ ｈ，测定提取液中蒙花苷含量，结果见图６。由图６可知，在其他条件相同情况下，从经济角度考虑，以洗脱剂体积比１∶２∶３提取为宜。

２．３正交优化试验

由表２可以看出，最佳提取工艺为Ａ２Ｂ３Ｃ３，即萃取时间为１．５ ｈ，萃取温度为３０ ℃，洗脱剂体积比为１∶２∶３。

３结论

利用新型的基质固相分散萃取技术提取野干燥花序中天然活性成分蒙花苷，通过对样品提取条件进行不同因素及水平比较，以及运用正交试验设计进行多因素综合分析，优选出了萃取时间、萃取温度、洗脱剂体积比３个因素的最优试验方案，建立了实用、简单、方便、易行的基质固相分散萃取蒙花苷的流程。野花序中蒙花苷的最佳提取工艺条件为：萃取时间1.5 h，萃取温度为30 ℃，溶液比1∶2∶3。

参考文献：

［１］ ．药用植物野的研究现状及发展前景［Ｊ］．现代中药研究与实践，２００７，２１（４）：５９－６２．

［２］ 刘国应．野的药理研究及临床应用进展［Ｊ］．山东中医杂志，１９９０，９（６）：３７－３９．

［３］ 华海清．野临床应用研究概况［Ｊ］．湖南中医药导报，１９９４，１（１０）：３６－３７．

［６］ 谭晓杰，贾英，李清，等．ＲＰ－ＨＰＬＣ法同时测定野中木犀草素－７－Ｏ－葡萄糖苷和蒙花苷［Ｊ］．中草药，２００６，３７（８）：１２６１－１２６２．

［７］ 陈蕾，霁虹． ＨＰＬＣ法测定野中蒙花苷的含量［Ｊ］．中国药事，２００５，１９（２）：９７－９８．

［４］ 崔兰冲，李小芩，韩莹，等．ＨＰＬＣ测定野中蒙花苷与木犀草素的含量［Ｊ］．中国中药杂志，２００７，３２（１）：３３－３５．

［５］ 李秀兰，孙光洁．密蒙花／结香有效成分的抑菌作用［Ｊ］．西北药学杂志，１９９６，１１（４）：１６５－１６６．

［８］ 陈惠芳．植物活性成分辞典［Ｍ］． 北京：中国医药科技出版社，２００１．１２－１３．

［９］ 魏娜，王强． 野及其相关制剂中蒙花苷的含量测定［Ｊ］．药学与临床研究，２００７，１５（３）：２２１－２２３．

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