高丛越桔UFGT基因电子克隆和生物信息学分析
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摘要 [目的]通过电子克隆技术对高丛越桔ufgt基因进行预测。[方法]以笃斯越橘UFGT序列为探针，基于NCBI中高丛越桔的EST数据库和CAP3在线软件进行序列拼接，利用生物信息学数据库及相关软件对其结构和功能进行预测分析。[结果]高丛越桔UFGT基因全长1 789 bp，包含1 161 bp的开放阅读框，编码386个氨基酸，该蛋白为亲水性蛋白。[结论]本研究为进一步解释基因的分子功能奠定理论及实验基础。
中图分类号 S662.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）06-0081-04
Analysis on Insilico Cloning and Bioinformatics of Vaccinium corymbosum UFGT Gene
XIN Xiao-juan 1 MA Wei 2 * LI Yu-cheng 3
（1 Daxing′ anling Academy of Agriculture and Forestry in Heilongjiang Province，Daxing′ anling Heilongjiang 165000； 2 Heilongjiang University of Chinese Medicine； 3 Daxing′ anling Forestry Administration）
Abstract [Objective]Using electronic cloning technology to predict UFGT gene of Vaccinium corymbosum.[Methods]Taking Vaccinium uliginosum UFGT sequence as the probe sequence，based on EST sequence from NCBI and assembled by CAP3 sequence assembly programme，using bioinformatics database and related software to predict the structure and function analysis.[Results]The full length of UFGT gene was 1 789 bp and it contained a 1 161 bp ORF，encoding 386 amino acid and the protein is a hydrophilic protein.[Conclusion]The study can provide theoretical and experi-mental basis for further explain of molecular genetic function.
Key words Vaccinium corymbosum；UFGT；insilico cloning；bioinformatics
高丛越桔（Vaccinium corymbosum）原产地为北美，是杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium）木本植物，比^适合在中国北方地区栽培，是经济价值最高的优良品种，因其果实大、品质佳、口感好深受人们青睐[1]。
类酮类化合物在高等植物界分布广泛，可以参与花、叶片及果实等颜色的形成，还具有抗炎、抗癌、抗氧化和保护心脑血管系统等多种药理作用[2]。植物中的类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶（UFGT）处于类黄酮合成途径中，形成各种花色苷[3]。目前，科研人员已在葡萄、玉米、水稻、草莓、荔枝等植物上对UFGT基因进行了分析研究[4-5]。
电子克隆是一种基因克隆方法，具有高效、快速、投入低，并可以为实验克隆提供精准的参考序列等优点[6-8]。
本研究基于电子克隆技术，对预测的高丛越桔的UFGT基因进行序列分析，从理化性质、亚细胞定位、氨基酸组成、信号肽、跨膜结构域等方面对该基因编码的蛋白进行了预测，以期为进一步解释基因的分子功能奠定理论及实验基础。
1 材料与方法
1.1 电子克隆获得新基因序列
以笃斯越橘UDP-glucose：flavo-noid 3-O-glucosyltran-sferase（UFGT）基因（KP218512）作为探针，使用Blastn工具检索NCBI中与探针序列同源性较高的高丛越桔EST序列，使用在线工具CAP3[9]进行拼接，以拼接好的重叠群（Contig）为探针，再次Blast检索，如此反复。
1.2 生物信息学分析
对预测的高丛越桔UFGT基因序列进行分析，具体在线生物信息学软件如表1所示。
2 结果与分析
2.1 新基因的识别
以笃斯越橘UDP-glucose：flavo-noid 3-O-glucosyltran-sferase（UFGT）基因（KP218512）为探针，获得全长为1 789 bp的Contig 1条，其开放阅读框长度为1 161 bp，编码386个氨基酸，具体见图1。
2.2 高丛越桔UFGT基因编码氨基酸一级结构预测
蛋白质是生命功能的执行者，分析蛋白质的氨基酸序列，是蛋白质研究的重要组成部分。基于蛋白质数据库，通过在线软件ProtParam[10]，对高丛越桔UFGT基因编码的氨基酸的一级结构预测见表2。
2.3 高丛越桔UFGT信号肽预测和分析
蛋白质的跨膜转运主要依靠信号肽指导。采用SignaIP-4.1 Server[11]，预测高丛越桔UFGT的信号肽，结果如图2所示。可以看出，高丛越桔UFGT基因所编码的蛋白质不存在信号肽，该蛋白不进行转运。
2.4 高丛越桔UFGT蛋白疏水性/亲水性分析
对高丛越桔UFGT编码的氨基酸用ProScale在线软件[12]进行亲疏水性预测，一般负值越大表示蛋白亲水性越强，正值越大疏水性越强，结果如图3所示。可以看出，高丛越桔UFGT编码的蛋白为亲水性蛋白质，最小值-1.476，最大值1.205，这与一级结构预测的结果一致。
2.5 高丛越桔UFGT蛋白质跨膜结构预测
生物膜功能的主要承担者为膜蛋白。通过在线跨膜蛋白结构预测TMpred软件预测其蛋白质跨膜区和跨膜方向，结果如图4所示。可以看出，该蛋白中存在3个跨膜区，即32-51、86-104、249-270氨基酸位置。
2.6 高丛越桔UFGT蛋白的亚细胞定位
蛋白质由位于细胞质中的核糖体合成之后，需要转运到合适的位置才能正常行使其功能。基于蛋白质数据库，使用Psort在线软件[13]对高丛越桔UFGT蛋白进行亚细胞定位，具体结果见图5。可以看出，该蛋白在细胞质和线粒体的概率是39.1%，在细胞核的概率是13.0%，在细胞液中有8.7%的概率，可能主要分布于细胞质和线粒体中。
2.7 高丛越桔UFGT蛋白的二级结构预测
蛋白质中约85%的残基处于3种稳定二级结构，即α-螺旋、β-折叠和β-转角。二级结构预测的目的是根据一级结构判断残基是否处于特定二级结构。基于蛋白数据库，通过在线软件SOPMA[14] 对高丛越桔UFGT蛋白进行二级结构预测，具体结果见图6。可以看出，该蛋白质的二级结构主要由4种形式组成，即由α-螺旋占41.97%，无规卷曲占30.57%，延伸链占17.88%，β-转角占9.59%。据此推测，α-螺旋是高丛越桔UFGT蛋白二级结构中数量最多的结构元件。
2.8 高丛越桔UFGT蛋白的三级结构预测
采用同源建模法，利用SWISS-MODEL在线软件[15]对高丛越桔UFGT蛋白的三级结构进行预测，具体结果见图7。可以看出，该蛋白主要有无规则卷曲、α-螺旋2种结构，同时还伴随着延伸链、β-转角2种结构，基本与二级结构预测结果一致。
2.9 蛋白质磷酸化位点分析
蛋白质翻译后有精氨酸甲基化、磷酸化、ADP核糖基化、糖基化等多种修饰形式，其中，磷酸化是一种重要的共价修饰方式。利用NetPhos 3.1 Server在线软件分析[16]的具体结果见图8。可以看出，有15个丝氨酸（Ser）、10个苏氨酸（Thr）、1个酪氨酸（Tyr）可能成为蛋白激酶磷酸化位点。
3 结论与讨论
目前，越桔具有较高的营养价值，且药理作用正逐渐被人们认识[17]。越桔含有丰富的多酚类物质，如黄酮醇、酚酸和花青素。其中黄酮醇具有降低心血管和退化性疾病的风险能力[18]。花青素被证明具有减轻炎症、降低血糖、影响脂质代谢和脂肪沉积、减少大分子的氧化损伤[19]等作用。
通过电子克隆技术预测高丛越桔UFGT基因，全长为1 789 bp，开放阅读框长度为1 161 bp，编码386个氨基酸。该蛋白为亲水性的非分泌蛋白，且其中存在一处跨膜区。该蛋白主要由α-螺旋、无规则卷曲构成的二级结构，在细胞质和线粒体中分布的可能性最大，有15个丝氨酸（Ser）、10个苏氨酸（Thr）、1个酪氨酸（Tyr）可能成为蛋白激酶磷酸化位点[20-21]。通过本研究预测的结果，为未来UFGT基因在高丛越桔中提取、克隆及基因功能方面的研究奠定基础，同时也为电子克隆技术的广泛应用提供参考。
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