藏红花素诱导人脑胶质瘤细胞U87凋亡的作用机制研究

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[摘要] 目的 探讨藏红花素促进人脑胶质瘤细胞U87凋亡的作用及其机制。 方法 培养U87细胞系，随机分为二甲基亚砜对照组（对照组）和藏红花素治疗组（藏红花素组）。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同剂量藏红花素（低浓度组、中浓度组、高浓度组）对人胶质瘤细胞U87增殖的影响；流式细胞仪观察细胞凋亡情况。Western-blot检测ERK1/2，p-ERK1/2的表达变化。 结果 与对照组比较，藏红花素组U87细胞的生存率明显降低；随着藏红花素浓度增加，U87细胞的凋亡率显著上升（18.92%51.68%70.12%），组间差异有统计学意义（χ2=14.102，P < 0.05）；Western-blot结果显示，与对照组比较，藏红花素组的p-ERK1/2表达降低，而高浓度藏红花素组p-ERK1/2表达降低最显著，不同组间差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 藏红花素可能呈剂量依赖性的通过抑制p-ERK1/2促进U87细胞凋亡，发挥重要的抗肿瘤作用。

[关键词] 藏红花素；U87胶质瘤细胞；凋亡；剂量依赖性；p-ERK1/2

[中图分类号] R739.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（c）-0011-03

藏红花（Crocus Sativas）是一种鸢尾科番红花属的多年生花卉，藏红花素（Crocin）是藏红花中提取的一种化学成分，是一种不常见的水溶性类胡萝卜素（二羧酸多烯单糖酯）[1]。药理学研究表明藏红花素不仅能够提高免疫功能，而且对肺癌、宫颈癌和胃癌等多种肿瘤细胞有明显的抑制作用，且毒副作用小，其抗癌机制可能与诱导细胞凋亡有关[2-4]。为进一步研究藏红花素对人脑胶质瘤的抑制作用及其机制，本文在培养人脑胶质瘤细胞u87的基础上，深入探讨了藏红花素诱导肿瘤凋亡的作用和具体分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

藏红花素、DMEM培养液、四甲基氮唑蓝（MTT）、青霉素、链霉素、Fluo-3AM均购自Sigma公司；U87购自美国ATCC；胰蛋白酶、胎牛血清均购自北京鼎国生物技术公司。兔抗人ERK1/2，p-ERK1/2单抗，山羊抗兔二抗购自美国Santa ctruz公司。空气净化台购至苏州净化设备厂，酶联仪器购至美国伯乐公司。

1.2 细胞培养

以干粉培养基溶解法制备DMEM培养液，并按要求调节pH后，用无菌滤膜过滤除菌后冻存。细胞培养时取出冻存DMEM培养液，加入10%胎牛血清、0.37%NaHCO3、0.42%HEPES、100 U/mL青霉素/链霉素制成DMEM细胞培养液，充分溶解后将U87脑胶质瘤细胞接种于培养液，然后置入5%CO2孵箱中培养，设置培养温度为37℃；采用酶消化法传代培养，消化液为0.25%胰蛋白酶、0.02%的EDTA。培养成熟的U87细胞随机分为二甲基亚砜对照组（对照组）、低剂量藏红花素处理组（低浓度组）、中剂量藏红花素处理组（中浓度组）和高剂量藏红花素处理组（高浓度组），共4组，每组重复6次。

1.3 细胞活力检测

细胞活力检测采用MTT法，选择处于对数生长期的U87细胞，分别对细胞进行计数，并配置密度为2×104/mL的细胞悬液，然后接种于含有96孔的培养板内，将所有培养孔分组，分别加入不同浓度的藏红花素（浓度分别为0、1、2.5、5 mg/mL），以加入DMEM培养液为对照；加液完成后培养板放入5%CO2孵箱中培养，设置培养温度为37℃，培养时间为24、48、72 h，实验结束前4 h每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL继续培养4 h，2000 r/min离心吸弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO）终止反应，震荡10 min。酶标分析仪检测490 nm波长的光密度值。抑制率（%）= （A对照组-A实验组）/A对照组×100%。

1.4 流式细胞术（FCM）检测凋亡细胞

取4个100 mL的培养瓶，均行U87细胞接种，均培养24 h，然后将培养液换成含藏红花素的培养液，继续培养24 h。培养后使用消化酶除壁后加入含血清的完全培养基，培养到时间后，轻微吹打使细胞脱壁，将含培养细胞的培养液按500 r/min离心5 min收集细胞，吸弃上清，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次。然后按照Annexin V FITC试剂盒说明书进行操作，用FCM定量分析细胞凋亡水平。

1.5 Western-blot法检测ERK1/2，p-ERK1/2表达

按照每泳道40 μg蛋白含量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结束后半干法转移蛋白至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入ERK1/2，p-ERK1/2和β-actin一抗4℃过夜。山羊抗兔二抗室温下1 h孵育，化学法发光，压片后分析结果。

1.6统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，多组间两两比较采用Dunnett-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 藏红花素抑制U87MG细胞增殖结果

在加入不同浓度藏红花素处理后，MTT法结果显示（图1），与对照组比较，不同浓度藏红花素（低浓度组、中浓度组、高浓度组）均可明显抑制U87MG细胞生长增殖（P < 0.05）；同时，随着药物孵育时间的延长，藏红花素对胶质瘤细胞的抑制作用也呈现增强趋势，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 藏红花素诱导U87MG细胞凋亡结果

采用FCM定量分析对照组和藏红花素处理24 h后U87MG细胞的凋亡情况（表1）。与对照组比较，藏红花素组随浓度增加U87MG细胞凋亡率增加，特别是高浓度组和中浓度组细胞调亡显著增加（P < 0.01）。另外，低浓度组和高浓度组、中浓度组细胞凋亡率组间差异有统计学意义（χ2=14.102，P < 0.05）。

2.3 藏红花素显著降低p-ERK1/2的表达结果

与对照组比较，藏红花素作用24 h后，脑胶质瘤U87MG细胞中p-ERK1/2低表达（P < 0.01）；随着藏红花素浓度的增加，ERK1/2和p-ERK1/2表达降低，各浓度组间差异有统计学意义（P < 0.05）。Western-blot结果见图2。

3 讨论

近年来，借助高效抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞信号转导、增强机体免疫及毒副作用小等优势，利用中药治疗各种肿瘤已成为肿瘤学界的研究热点。藏红花素系从藏红花植物中提取的有效单体，具有抗微生物、抗肿瘤、抗衰老、提高机体免疫力等多种药理作用，且其通过诱导凋亡、抑制增殖和影响细胞周期等机制对胃癌、大肠癌、肝癌、肺癌和宫颈癌等多种肿瘤均有显著防治功效[5-6]。

近年来，研究发现发现藏红花的花蕊中含有的藏红花素、藏红花苦素等都具有较强的抗癌活性，其抗癌机制是抑制癌细胞的DNA和RNA合成，抑制细胞蛋白激酶的活性和原癌基因的表达，抑制苯并芘和12-O-14酰基磷酮-13乙酸盐（TPA）等致癌物质的毒性，从分子水平抑制肿瘤的形成[7]。另外藏红花的毒性明显低于常用的抗癌化疗药物维甲酸，因此，藏红花素等抗癌活性物质是一种较理想的抗癌药物。学者研究显示，藏红花酸、五羧黄酮和顺铂均对人横纹肌肉瘤细胞有抑制作用，研究表明，藏红花素能抑制因TPA诱发的大鼠皮肿瘤细胞，夏丹[8]研究发现，藏红花的萃取物可以抑制人肿瘤细胞的生长。

本文研究显示，藏红花素对人脑胶质瘤细胞具有明显的抑制作用，且随着培养液中藏红花浓度的增加，或随着药物孵育时间的延长，藏红花素对U87MG胶质瘤细胞的抑制作用也呈现增强趋势，此外不同藏红花素还可以引起细胞凋亡率的增加，从而证实藏红花素在抑制脑胶质瘤细胞增殖及诱导胶质瘤细胞凋亡方面有重要作用，与上述文献报道相符。MAPK信号转导通路是细胞内重要的信号转导系统，ERK作为MAPKs家族一个重要亚族，促进多种基因，特别是凋亡基因的转录与表达，进而促进细胞增殖、分化、迁移、侵袭，抑制细胞凋亡等[9-10]。Wu等[11]报道，胶质瘤中ERK1/2的激活使转录因子磷酸化，进而调节基因的表达，促进细胞增殖、阻止细胞凋亡，在神经胶质瘤细胞的凋亡过程中发挥重要作用；进一步研究发现，藏红花素可以抑制ERK1/2分子磷酸化，进而调节c-Caspase3等凋亡基因表达[12]，促进胶质瘤细胞的凋亡，发挥强大的抗肿瘤作用。本文研究显示藏红花素作用24 h后，脑胶质瘤U87MG细胞中p-ERK1/2低表达，并且随着藏红花素浓度的增加，ERK1/2和p-ERK1/2表达降低，提示藏红花素可能通过抑制p-ERK1/2促进U87细胞凋亡，并且呈剂量依赖性。

总之，本实验初步证实了藏红花素处理具有显著的抗肿瘤作用，并呈剂量依赖性。这种作用机制极可能是通过调控p-ERK1/2的表达，诱发U87细胞大量凋亡，发挥重要的抗肿瘤作用，这为藏红花素更深入的研究提供可靠的实验证据和理论依据。

[参考文献]

[1] Jnaneshwari S，Hemshekhar M，Santhosh MS，et al. Crocin，a dietary colorant mitigates cyclophosphamide-induced organ toxicity by modulating antioxidant status and inflammatory cytokines[J]. J Pharm Pharmacol，2013，65（4）：604-614.

[2] Rastgoo M，Hosseinzadeh H，Alavizadeh H，et al. Antitumor activity of PEGylated nanoliposomes containing Crocin in mice bearing C26 colon carcinoma [J]. Planta Med，2013，79（6）：447-451.

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[5] Jnaneshwari S，Hemshekhar M，Santhosh MS，et al. Crocin， a dietary colorant mitigates cyclophosphamide-induced organ toxicity by modulating antioxidant status and inflammatory cytokines[J]. J Pharm Pharmacol，2013，65（4）：604-614.

[6] Ishizuka F，Shimazawa M，Umigai N，et al. Crocetin， a carotenoid derivative， inhibits retinal ischemic damage in mice[J]. Eur J Pharmacol，2013，703（1-3）：1-10.

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[8] 夏丹.藏红花素的抗肿瘤作用[J].国际肿瘤学杂志，2012，39（12）：21-23.

[9] Nissan MH，Rosen N，Solit DB. ERK Pathway Inhibitors： How Low Should We Go？ [J] Cancer Discov，2013，3（7）：719-721.

[10] Breindel JL，Haskins JW，Cowell EP，et al. EGF Receptor activates MET through MAP kinases to enhance non-small cell lung carcinoma invasion and brain metastasis [J]. Cancer Res，2013，21：11.

[11] Wu CJ，Qian X，O'Rourke DM. Sustained mitogen-activated protein kinase activation is induced by transforming erbB receptor complexes [J]. DNA Cell Biol，1999，18（10）：731-741.

[12] 霍军丽，甄海宁，刘卫平，等.藏红花素诱导人胶质瘤U251细胞内质网应激性凋亡的研究[J].现代生物医学进展，2011，11（22）：4212-4214.

（收稿日期：2013-08-13 本文编辑：卫 轲）