热疗对顺铂耐药的卵巢癌化疗增敏作用体外实验研究

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摘 要：目的：热疗是一种古老的疗法，热疗除了能够直接杀伤癌细胞外，还具有放射增敏和化疗增敏作用。本实验研究的目的旨在探讨热疗与顺铂联合对人卵巢癌顺铂耐药细胞株 CAOV3/cDDP的生长抑制作用以及温度与药效的关系。方法：将热疗(42℃)和顺铂(6、12、24μg/mL)分别单独以及联合作用于体外培养的人卵巢癌CAOV3/cDDP细胞株。采用MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)法检测各实验组人卵巢癌耐药细胞株CAOV3/cDDP的生长抑制率；采用集落形成实验观察各实验组对人卵巢癌耐药细胞株CAOV3/cDDP的诱导分化作用；应用光镜观察实验处理前后人卵巢癌CAOV3/cDDP细胞形态和结构的变化，确定凋亡细胞，评价各组细胞凋亡程度。结果：42℃热疗单独作用对肿瘤细胞的生长仅有轻度抑制作用，但它能显著增强顺铂对肿瘤细胞的抑制效应。受热42℃的顺铂与37℃生理温度下的顺铂相比较，前者对体外培养的肿瘤细胞有明显的杀伤作用(P

关键词：热疗；顺铂；卵巢癌细胞；培养的；细胞凋亡；联合疗法

中图分类号：R737.31

文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)03-0513-03

The Study of Hyperthermia Enhancing the Chemotherapy Action of Cisplatin on Drug-resistant Human Ovarian Cancer Cell

PAN Yu-zhen，YIN Dong-feng，GAO Hong，LIU Xin，PAN Lin

(Department of Oncology，Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM，Shenyang 110032，Liaoning，China)

Abstract：Objective：The objective of this study to determine the effect of inhibition of cell growth of hyperthermia in combination with cisplatin on drug-resistant human ovarian cancer cell line CAOV3/cDDP， and the relationship between temperature and medical effect. Methods：CAOV3/cDDP cell line were treated by hyperthermia (42℃) or cisplatin (6，12，24μg/mL) alone， or by the combination of them. The growth inhibiting rates to human ovarian cancer cell line CAOV3/cDDP were determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. Signs of induction differentiation were observed by colony forming units assay，respectively.Light microscopy was applied to examine the changes in morphology and structure of CAOV3/cDDP cell line， in order to evaluate cell apoptosis. Results：It was found that compared with various concentrations of cisplatin， hyperthermia at 42℃ with cisplatin markedly inhibited the cell growth(P

Keywords：hyperthermia；cisplatin；ovarian cancer；cultured；apoptosis；concomitant treatment

顺铂是一种高效广谱的抗癌药，以铂类为基础的联合化疗在对卵巢癌的治疗中有重要的地位，其疗效呈剂量相关性，但大剂量可以引起不可逆性肾功能损害及严重的胃肠道反应，从而限制了临床应用及疗效的进一步提高。此外肿瘤细胞对顺铂产生耐药性也是卵巢癌治疗中的一个重要问题，顺铂与其他疗法合用有助于克服这一难题[1]。热疗除了能够直接杀伤癌细胞外，还具有化疗增敏作用即热化疗效应，两者结合可以提高抗肿瘤效果。本实验旨在从细胞水平上，观察热疗对卵巢癌化疗的增敏作用，并探讨其抗肿瘤的作用机理。

1 实验材料

1.1 细胞系

CAOV3/cDDP为人上皮性卵巢癌细胞系，且为顺铂耐药株群，能抵抗3.0μg/mL的顺铂(经预实验证实)，由中国医科大学细胞生物实验室提供。

1.2 药品来源

顺铂注射液(DDP)：昆明三戌贵金属药业有限公司产品，制剂规格为10mg/2mL，批准文号为滇卫药准字(1998)第003359号。

2 实验方法

2.1 细胞培养

用含10%小牛血清、8万U/L庆大霉素的RPMI-1640培养液，在37℃含5%CO2饱和湿度的温箱中松盖培养48h，至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化3min，终止反应，吹打，制备成单细胞悬液，准确计数，调整细胞浓度至1×105个/mL，待用。所测实验指标不同，将细胞分别接种于96孔板、6孔板、及盖玻片上。

2.2药物工作浓度设置

顺铂注射液(DDP)：昆明三戌贵金属药业有限公司产品，制剂规格为10mg/2mL，批准文号为滇卫药准字(1998)第003359号。

采用MTT法进行顺铂细胞毒性实验。5mg/mL顺铂用RPMI-1640培养液稀释成300、210、150、90、60、30、24、15、12、6、3μg/mL几种不同浓度。该浓度按已知临床药物血浆峰值浓度(PPC)设定[2]，分别为10PPC、7PPC、5PPC、3PPC、2PPC、1PPC、0.5PPC、0.25PPC、0.1PPC。根据MTT结果，计算细胞生长抑制率，绘制顺铂的剂量效应曲线。确定顺铂最高无毒剂量为3.0μg/mL，半数致死量(IC50)为150μg/mL。选择小于IC50的顺铂浓度作为工作浓度，分别为6、12、24μg/mL，其抑制率分别为19.1%、33.4%、41%。

2.3 实验分组

本实验共分4组：(1)空白对照组；(2)化疗组(顺铂)；(3)热疗组(温度42℃)；(4)热化疗组(热疗+顺铂)。

化疗组予不同浓度的顺铂药物(6、12、24μg/mL)；热疗组给予42℃温热处理；热化疗组指42℃热疗同时，予不同浓度的顺铂；空白对照组为温度37℃时未加药组。

2.4 实验各组处理方法

2.4.1 顺铂处理 加入含顺铂的RPMI-1640培养液，96孔板、0.2mL/孔，6孔板、2mL/孔，培养皿、4mL/个。顺铂的浓度分别为6、12、24μg/mL。然后置入培养体系中培养。顺铂与细胞接触时间为24h，中间换液1次，即培养12h后，换1次与原来相同浓度的药液，以保持培养基中顺铂的浓度。顺铂的半衰期大约为10～20h[3]。空白对照组加入等量培养液，其他处理相同。

2.4.2 顺铂加热疗处理 在2.4.1所述的顺铂处理后，立即将细胞置于42℃的温箱中，热疗处理30min。然后置于培养体系中培养24h，药物作用12h换液1次，换液后立即给予同前所述的热疗处理。空白对照组加入等量培养液，细胞置于37℃(生理温度)的温箱中，其他处理相同。热疗处理时，以培养皿内或孔内培养液温度升至42℃开始计算时间。

3 实验指标测定

3.1 MTT法测定细胞生长抑制率

96孔板培养的细胞，经上述处理后，进行MTT法测定。测定时，弃去培养基，加入MTT溶液20μL/孔，(浓度为5g/L，PBS配制)，放置37℃、5%CO2培养箱中继续培养4h后，翻板、弃上清，每孔加入DMSO 200μL，充分振荡10～30min，至甲完全溶解后，在酶标仪上，测定490nm波长下，对照组及各实验组每孔的光密度值A。按下列公式计算细胞生长抑制率。上述实验重复3次，计算平均值与标准差。

细胞生长抑制率(%)=(1-实验孔光密度A值/空白对照孔光密度A值)×100%

3.2 药物联合作用评价[4]

采用两药相互作用指数(CDI)，评价药物联合作用性质。CDI按下列公式计算：

CDI= AB/(A×B)

根据MTT所测光密度值(活细胞数)进行计算，A或B是顺铂或热疗单独使用组与对照组光密度值的比值，AB是顺铂与热疗联合组与对照组光密度值的比值。评价药物相互作用标准[5]见表1。

3.3 细胞集落形成法测定集落形成率

6孔板培养的细胞，经上述处理后，弃去培养基，用0.9%生理盐水洗涤2次，祛除残存药液，加入含10%小牛血清的PRMI-1640培养液，2mL/孔。置37℃，5%CO2温箱中，常规培养10天后，用瑞氏-吉姆萨染色，在显微镜下计数>50个细胞的克隆数。取3个复孔均值，按下式计算集落形成率。

集落形成率(%)=(实验组集落均数/空白对照组集落均数)×100%

3.4 细胞形态学观察

3.4.1相差显微镜观察 经上述处理后，相差显微镜下动态观察，接种于盖玻片上的对照组和各实验组细胞的形态变化。

3.4.2光学显微镜观察 经上述处理及动态观察后，将培养皿中的盖玻片捞出，PBS液漂洗2次，95%酒精室温固定20～30min，0.05%瑞氏-吉姆萨染色15～30min，冲洗凉干，二甲苯透明后，直接反转，放于洁净载玻片上，树胶封片。光镜下观察，确定凋亡细胞。

3.5 数据处理

采用F检验，t检验，SPSS11.0统计软件包进行统计分析。

4 结 果

4.1 卵巢癌CAOV3/cDDP细胞生长抑制率

MTT法测定化疗组、热化疗组细胞生长抑制率结果见表2。

4.2 药物联合作用结果

计算热疗与顺铂相互作用指数(CDI)值，热疗与各浓度顺铂联合作用于卵巢癌CAOV3/cDDP细胞60min，CDI

4.3 卵巢癌CAOV3/CDDP细胞集落形成率

实验组较对照组相比集落生长特性明显降低，细胞呈单个生长状态，且单个集落中细胞数显著少于对照组。热化疗组细胞集落形成率较单独化疗组明显降低(P

4.4细胞形态学变化

相差显微镜动态观察了对照组和各实验组细胞形态的变化，根据上述药物作用效应分级标准，评价各实验组药物作用等级，详见表4。观察发现药物作用强度在一定范围内呈现对浓度、温度和时间的正相关性。各实验处理对人卵巢癌CAOV3/cDDP的作用主要表现在对卵巢癌细胞贴壁能力的影响和细胞大小、形态的变化。药物作用等级不同，对卵巢癌CAOV3/cDDP细胞的影响也不同：药物作用效应在3～4度之间的各实验组，给药12h细胞就出现体积缩小、皱缩、不规则分裂、胞膜出泡现象，细胞贴壁能力明显下降，许多细胞脱落呈漂浮生长状态，随作用时间延长，脱落细胞逐渐增多，至24h时约70%～80%的细胞呈悬浮生长；作用效应在2～3度之间的各实验组，药物作用后，细胞逐渐变圆、变粗糙、折光性减弱，24h这种现象更明显，同时有部分细胞鼓泡、漂浮；作用效应在1～2度之间的各实验组，药物作用后细胞稍变小，大多数细胞仍呈梭性，部分细胞变圆，随时间延长改变明显，24h可见大多数细胞变小变圆，细胞贴壁能力稍下降，极少细胞脱落，细胞生长仍呈集落性。空白对照组未出现上述现象，细胞呈典型梭形、平滑、折光性好，分裂期细胞变成圆形，折光变强(见图1～3)。

5 讨 论

热疗是一种古老的疗法，随着基础研究的深入及热疗设备的开发研制和应用，热疗已得到了迅速的发展。热疗除了能够直接杀伤癌细胞外，还具有放射增敏和化疗增敏作用。热疗造成的组织损伤主要取决于作用温度和持续时间，41℃以上即可以产生癌细胞杀伤作用，酸性环境对上述机制有促进作用。热疗剂量是影响疗效的最重要因素之一。体内及体外实验均证实热疗可以促进一些化疗药物的细胞毒作用。对大多数化疗药物而言，中等程度的热疗(40.5℃～43℃)可以最大限度地促进其疗效。但目前尚缺乏标准化的热化疗模式。

本实验采用对顺铂耐药的CAOV3/cDDP人卵巢癌细胞进行实验研究。实验结果显示，42℃热疗单独作用对肿瘤细胞的生长仅有轻度抑制作用，但它能显著增强顺铂对肿瘤细胞的抑制效应。受热42℃的顺铂与37℃生理温度下的顺铂相比较，前者对体外培养的肿瘤细胞有明显的杀伤作用(P

热疗能增强顺铂的作用，推测热疗与顺铂之间的协同作用原因可能是：(1)高温作用于细胞膜，使膜的通透性增高，从而增加了肿瘤细胞内药物浓度，提高了药物对DNA的杀伤力。(2)同时反过来顺铂又抑制了细胞热损伤后的修复。二者之间存在着互补与协同作用。因此建议在临床化疗治疗中，可采用提高温度依赖性化疗药物温度的方法，提高治疗效果。这样不仅可解决多药耐药问题，提高了化疗疗效，而且较增强药物浓度方法，其毒副作用小，疗效好，同时操作简便，值得临床推广应用。

参考文献

[1] Raaphorst GP， Yang DP， Grewaal D， et al. Analysis of mechanisms of cisplatin resistance in three pairs of human tumor cell lines expressing normal and resistant responses to cisplatin[J]. Oncology Resports， 1995，2：1037.

[2] 张卓然.实用细胞培养技术[M].北京：人民卫生出版社，1999：96.

[3] Raaphorst GP， Wang G， Stewart DJ， et al. Concomitant low dose rate irradiation and cisplatin treatment in ovarian carcinoma cell lines sensitive and resistant to cisplatin treatment[J]. Int J Radiat Biol，1996，69(5)：623.

[4] Cao SS， zhen YS. Potentiation of antimetabolite antitumor activity in vivo by dipyridamole and amphotericin B [J]. Cancer Chemother pharmacol，1989， 24：181-186.

[5] 汤秀红.三氧化二砷与顺铂和用抗人肝癌细胞株QGY-7701的实验研究[J].肿瘤防治研究，2002，29(5)：362-364.