酶联免疫吸附试验(ELISA)注意事项

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摘 要：本文主要探讨了酶联免疫吸附试验（elisa）中常见的影响因素，对学生实验中常出现的问题进行原因分析，并总结解决办法。ELISA试验操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，有可能导致显色不全、假阴性或假阳性结果。

关键词：酶联免疫;吸附试验;满版

实验室常用固相酶免疫测定方法在1971年最初建立，称为酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunsorbent assay），简称ELISA。原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。

影响酶联免疫测定的因素较多，如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、温度的控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等，均可能对试验结果产生很大影响。只有避免这些因素，才能保证试验结果的准确性和可靠性。

一、移液枪的使用

我院免疫实验室常用手动单道移液器。注意事项：（1）吸样前要保证枪头和液体处于相同温度;（2）若容量瓶中的液体太少，可倒入ep管中，方便吸取;（3）严格精确调节方法;（4）安装枪头要垂直插入，左右轻微转动上紧，上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散;（5）垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2～4mm以下，一般液体，正向吸液1～2档，粘稠液可反向吸液2～1档，缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度，太快会产生反冲和气泡，吸取后将移液枪提离液面，停顿1秒钟，观察是否有液滴流出，若有流出，说明有漏气现象;（6）放液时将吸嘴贴到容器内壁并保持10～400倾斜，平稳把按钮压到1档，停约一秒钟到2档，排出剩余液体。

吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，不能突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。

移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置。

不要将按钮旋转出量程，否则会卡住内部机修装置而损坏;长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，可延长使用寿命;定期对移液枪校准。

二、加样

加样不可太快，要避免加在孔壁上部。不可溅出和产生气泡，如有气泡，抗原抗体不能有效地结合会导致弱阳性甚至假阴性。

三、温育

ELISA属于固相免疫测定，抗原和抗体必须在一定温度条件下反应一定的时间，微孔板从室温至恒温箱升至37℃，也需要一定时间。而在临床实验中很少人注意这个问题，通常以放入温箱即开始计时，这样弱阳性样本测不出来，为避免蒸发，板上应封盖。

四、洗版

在实验室中，ELISA测定的洗版一般有两种方式，即手工和洗板机洗版，用洗板机洗版结果准确可靠。

五、显色

一般显色反应条件为37或室温反应15～30分钟。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔随时间的延长而呈色加强，加TMB作用后，2小时可完全消退至无色。

六、比色

ELISA比色用酶标仪进行，应注意：

酶标仪不应放置在强光照射下，使用前先预热15～30分钟。波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确，通常我们在软件选项中选择双波长比色，它是在敏感波长450nm和非敏感波长630nm下两次吸光度的差值。

七、ELISA实际操作中常见问题和解决办法

1.显色淡，灵敏度低

实验前试剂盒至于室温30分钟以上，保温期内不宜多开门。换用合格的蒸馏水，不要使用过期试剂。

2.满版白，阳性对照不显色

严格按照试剂说明书操作，加液时看准标签。选用洁净量筒，正确稀释洗涤液，不要漏加试剂。

3.满板显色

显色时应避免保温，调准培养箱温度。样品应新鲜，长期保存在-20℃冷冻保存。防止污染，孵育时贴封片或加盖，洗涤要充分。

八、结论

酶联免疫吸附试验以灵敏度高、特异性好等特点，在临床上得到了广泛应用，严谨的设计、优质的试剂、良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。

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